蛋白质的测定原理1 08.11.25 2.ppt

全氮的测定 凯氏定氮法：消化、蒸馏、吸收、滴定 。 杜马斯燃烧法 ：燃烧、还原、净化、检测 。 凯氏定氮法 凯氏法测定试样中的含氮量，即在催化剂作用下，用硫酸破坏有机物，使含氮物转化成硫酸铵。加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收后，再用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。 原 理 实验反应 : 1.试样中的氮在强热条件下CuSO4， K2SO4 , 浓H2SO4 作用下， 消化生成（NH4）2SO4 NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中。 (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH NH3+H3BO3=NH4H2BO3 3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。 NH4H2BO3 + HCl =H3BO3 + NH4Cl 各种试剂的作用 硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C， 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，本身还原为SO2，而pro则分解成氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中 1. 消化： 硫酸钾：提高温度。 1. 它与硫酸反应生成硫酸氢钾，一般纯硫酸加热沸点330℃，温度可达400℃，加速了整个反应过程。 此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类。 理由：随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。加速了有机的分解。 3. 硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。 硫酸铜： 1.催化剂 加速反应 硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢作为氧化剂，次氯酸钾防止污染通常使用硫酸铜。 2.碱性反应指示剂 ??? 有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，可以作为指示剂。 方程式 CuSO4=Cu2SO4+SO2+O2 Cu2SO4+2H2SO4=CuSO4+H2O+SO2 C+CuSO4=Cu2SO4+SO2+CO2 蓝绿色 褐色 2. 蒸馏： 样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。 3. 吸收与滴定：??? 蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。??? 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。 计算公式： 粗蛋白质（％）=（V2-V1）·c×0.0140×6.25/（m×V ’/V） ×100 式中：V2─ 滴定试样时所需标准酸溶液体积，mL； V1── 滴定空白时所需标准酸溶液体积，mL； c── 盐酸标准溶液浓度，mol/L； m── 试样质量，g； V── 试样分解液总体积，mL； V‘ ── 试样分解液蒸馏用体积，mL； 0.0140── 与1.00mL盐酸标准溶液〔c（HCl）=1.000mol/L〕相当的、以克表示的氮的质量。 6.25─ 氮换算成蛋白质的平均系数。 注意事项 （1）K氏烧瓶和取样量 （2）分解剂??? A??H2SO4和K2SO4的添加量 1g样品???? K2SO4：? H2SO4=7g：12ml? 这种比例在国内外公认。 还有一种比例：?? K2SO4：H2SO4=10：20ml B? 催化剂 （3）热源的强度 4.向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物。浓碱与硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀，有时Cu离子与氨作用生成深兰色的络合物。 实验仪器: 凯氏烧瓶（100ml）:1个 凯氏定氮装置 移液管(10ml): 1支 酸式滴定管(10ml): 1支 1.安全管 2.导管 3.汽水分离管 4.样品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔热液套 9.反应管 10.蒸汽发生瓶 凯氏定氮装置图