第十张复制.PPTVIP

DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication 参与DNA复制的物质 DNA复 制系统 底物 dNTP 聚合酶 DNA-pol 模板 解成单链单链 的DNA母链 引物 与模板互补的 RNA片段 其它酶 和蛋白质因子 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶 简写 为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3?-OH末端使dNTP可以依次聚合 解螺旋酶 引物酶 单链DNA结合蛋白 DNA连接酶等 二、DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol 活性（作用）有两方面： 5??3? 的聚合活性， 延5??3?方向延长脱氧核苷酸链。 核酸外切酶活性（两种情况） 3? ? 5?外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5? ? 3?外切酶活性，能切除突变的 DNA片段。 核酸外切酶活性 3? → 5?外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5? → 3? 外切酶活性能切除突变的 DNA片段。 合成中的DNA分子 （一）原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol Ⅰ DNA-pol Ⅱ DNA-pol Ⅲ 三种酶共同点： 都具有 5? → 3? 聚合酶活性 3? → 5?外切酶活性 2.聚合酶 在复制延长时 对碱基的选择功能 1. 遵守 严格的 碱基配对规律 3.复制出错时 DNA-pol的 及时校读功能 DNA复制的 保真性 至少要依赖 三种机制 四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。 （一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白 拓扑异构酶Ⅰ 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。 拓扑异构酶Ⅱ 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。 拓扑异构酶的作用 五、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)作用方式 连接DNA链3?-OH末端和相邻DNA链5?-P末端，使二者生成磷酸二酯键，把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 DNA连接酶功能 在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。 * * 功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。 DNA-pol Ⅰ（109kD） B F A H K I J R N M P L O Q G D E C 18个α-螺旋区组成（A→R） H和I螺旋之间有较大的非螺旋区 50个氨基酸（未标示出） 小片段（A－F）323肽 5? ? ??核酸外切酶活性 大片段/Klenow 片段（ G－R）, 604肽 DNA聚合酶活性\?? ? 5? 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。 N 端 C 端 木瓜蛋白酶 DNA-pol Ⅰ B F A D E C H K I J R N M P L O Q G DNA-pol Ⅱ（120kD） DNA-pol Ⅱ基因发生突变，细菌依然能存活。 据此推想： 此酶是在 Pol Ⅰ、Ⅲ 缺失情况下暂时起作用。 DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，可以利用损伤的DNA模板催化核苷酸聚合。 因此认为： 它参与DNA损伤的应急状态修复（SOS修复）。 （见本章第四节）。 * * DNA-pol Ⅲ(250kD) 功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 * α β β τ τ θ θ λ λ α ε β ε β (δδ’χφ)2 Pol Ⅲ活性高于Pol Ⅰ： 每分钟达105次聚合反应 。 据此认为： 此酶是原核生物DNA复制延长反应中真正起作用的酶。 DNA－Pol Ⅲ由10种亚基组成不对称的异源二聚体。 核心酶： αεθ亚基组成，兼有5’－3’聚合及3’－5’外切活性。 ε亚基为复制保真性所必需。 β亚基可以夹稳模板，并使酶沿模板移动。 其余亚基统称为λ-复合物，作用是促进全酶组装至模板，增强核心酶作用。 * * + — 20 多亚基不对称二聚体 250 DNA-Pol Ⅲ — — ？ ？ 120 DNA-Pol Ⅱ + + 400 单肽链 109 DNA