- 1、本文档共71页,可阅读全部内容。
- 2、有哪些信誉好的足球投注网站(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 5、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 6、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 7、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 8、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶在麦胚无细胞蛋白合成系统中的表达和优化
摘 要
本研究在成功克隆得到江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶目的基因的基础上,在蛇毒
激肽释放酶基因序列上引入 BamHI 和 Xho I 两个酶切位点以及由六个组氨酸组
成的组氨酸标签,并将其与pCS2+表达载体相连,构建了质粒pCS2+/ VK,经过酶
切测序验证插入方向正确且未引起碱基序列的变化。
将pCS2+/ VK 线性化后,进行体外转录,得到适合进行翻译的模板mRNA 。
再将mRNA 同自制麦胚抽提物以及翻译缓冲液混合,26 °C 孵育16 h,将反应后
的混合物进行SDS电泳,能够得到一条大约43kDa 的条带,经Western blot
验证为所需要目的蛋白。
麦胚无细胞蛋白表达系统在安全准确的合成功能蛋白方面具有很大的潜力,
但是能源物质的供应以及模板 mRNA 的稳定性一直是影响系统产率的主要因素。
本文中磷酸肌酸和丙酮酸作为提供ATP 二次能源物质加入系统中,在对蛋白产
率进行比较之后,发现磷酸肌酸更适合于麦胚无细胞蛋白合成系统;为了提高
mRNA 模板稳定性,向系统中补充了质粒载体、SP6 RNA 聚合酶以及铜离子,
并对这些条件进行了优化,最终建立了一个高效快速的麦胚无细胞蛋白合成系统。
当向系统中加入30 ng/μL 质粒载体、15 U SP6 RNA 聚合酶、25 mM 磷酸肌酸
以及5 mM Cu2+后,并在26 °C 反应16 h 时,蛇毒激肽释放酶产量从0.13 mg/mL
提高到 0.74 mg/mL 。
通过固定化金属亲和层析法 (IMAC) 对重组蛇毒激肽释放酶进行分离纯化,
将纯化后的蛋白透析冻干,将重组蛋白(1.3 U/mg)与天然蛇毒激肽释放酶(1.736
U/mg) 以及去糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶(1.528 U/mg)的活性进行了对比,发
现重组蛇毒激肽释放酶比活力与天然蛇毒激肽释放酶比活力差异不显著,而与去
糖基化后的天然蛇毒激肽释放酶更接近。
本研究成果为进一步开展江浙蝮蛇蛇毒激肽释放酶结构功能研究以及麦胚
无细胞蛋白合成系统的工业化应用奠定了良好的基础。
关键词: 无细胞蛋白合成 麦胚 蛇毒激肽释放酶 重组蛋白
ABSTRACT
The genome DNA of kallikrein from Agkistrodon halys pallas snake venom has
been successful cloned. In this study, two restriction enzyme sites BamHI and Xho I
and the His tag including six histidines have been added to the genome DNA of
venom kallikrein. And the whole DNA was ligated into pCS2+, generating pCS2+/ VK.
The insertion was indentified by restriction analysis and sequencing.
After the linearization of pCS2+/ VK, the plasmid was transcribed in vitro and the
mRNA of venom kallikrein was obtained. Then the mRNA of venom kallikrein was
mixed with wheat germ extract and translation buffer and incubated at 26 °C for 16 h.
After analyzed by SDSelectrophoresis and Western blot, the size of
recombination venom kallikrein was about 43 kDa.
Wheat germ cell-free protein synthesis system h
您可能关注的文档
- 植物杀菌剂的提取及在可食性膜中的应用.pdf
- 椎间盘真空现象与终板信号改变Modic改变的相关研究.pdf
- 椎动脉优势与眩晕相关性研究.pdf
- 椭圆曲线6Y2X3X6上的整数点.pdf
- 椭圆曲线结合前向安全的代理签名研究.pdf
- 槲皮素纳米结晶混悬剂的研究.pdf
- 模具生命周期管理系统开发研究.pdf
- 模拟微重力对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响.pdf
- 模糊支持向量机关键技术研究.pdf
- 欧拉反褶积在断裂识别中的应用.pdf
- 高中生视角下科技创新实验室课程体系构建与教学效果评价教学研究课题报告.docx
- 2025年职业资格考试培训平台跨平台运营策略研究报告.docx
- 2025四川省属公费师范毕业生考核招聘85人模拟试卷附答案详解.docx
- 2025四川省达州市“达人英才计划”事业单位引才59人(武汉场)模拟试卷及完整答案详解1套.docx
- 2025四川省第五人民医院医学美容科、超声科、中西医结合科医师招聘3人模拟试卷参考答案详解.docx
- 2025年职业资格考试培训平台虚拟现实技术在沉浸式学习中的应用.docx
- 2025四川省妇幼保健院乳腺甲状腺专科医师招聘1人模拟试卷及答案详解1套.docx
- 房建超危工程施工方案(3篇).docx
- 2025四川省妇幼保健院乳腺甲状腺专科医师招聘1人模拟试卷及答案详解1套.docx
- 2025四川省妇幼保健院乳腺甲状腺专科医师招聘1人考前自测高频考点模拟试题及参考答案详解.docx
文档评论(0)