微生物遗传-10-育种B.ppt

4、微生物育种的基本策略和方法 4.1 微生物育种的基本策略 首先要明确育种的目的 提高目的产物的产量 对环境的更强耐受性（抗药性、抗盐碱、抗酸、抗高温或抗毒性等） 新产物 选择合适、高效的筛选方法 选择育种方法 随机诱变→定向筛选 定向改造→定向筛选 4.2 微生物育种的主要方法 诱变育种（点的随机变化） 利用物理、化学或生物等诱变因素处理微生物细胞，使细胞内的遗传物质-DNA分子结构发生变化，导致微生物的遗传发生变异，从中筛选所需菌株。 杂交育种（片段的随机变化） 用已知遗传性状的供体和受体菌株为亲本，通过转导、接合、原生质体融合、有性杂交、准性生殖及分子杂交等手段，从杂交子代中选出优良菌株。 基因工程（片段的定向变化） 自发突变与育种 生产选育：富于实际经验并且善于细致观察的人们在日常生产过程中，发现自然突变，选育优良菌株。 定向培育：用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。过程十分缓慢，“守株待兔” 。例如：低温菌的驯化。 诱变育种 诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应 复合处理的方法：两种或多种诱变剂的先后使用；同一种诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。 确定合适剂量，要多次试验 正变较多出现在偏低剂量中，负变则相反；经多次诱变而提高产量的菌株，更容易出现负变。 过去用紫外线作诱变剂，常采用杀菌率为99或99.9%的剂量，近年来倾向于采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。 产淀粉酶菌株筛选 原生质体融合育种原理 将两个亲株细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体； 将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使细胞质融合； 通过两套基因组之间的接触、交换，发生基因组的遗传重组，在再生细胞中获得重组体。 基因工程三大要素：供体、受体和载体 基因工程育种 带有外源基因的表达载体直接在受体细胞中表达目的产物。 通过重组（同源重组或位点专一性重组），外源基因整合到受体细胞基因组，表达目的产物。 通过重组，外源DNA整合到受体细胞基因组，改变代谢途径（转座子的随机突变）。 4.3 规定区域的随机诱变技术DNA改组 4.3.1 PCR技术 体外大量扩增DNA分子的技术 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 PCR的基本原理 PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点 4.3.2 易错PCR 是指通过改变PCR 的反应条件，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。 在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，所以属于无性进化。由于它较为费力、耗时，一般多用于较小基因片段（＜800 bp） 的改造。 建立基因突变库的方法 随机诱变： 易错PCR法(Error-prone PCR)—— 降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+ 易错PCR 4.3.3 ＤＮＡ改组（DNA shuffling） 是目前最方便、有效的一种分子水平的体外定向进化技术，该技术同倾向错误ＰＣＲ相结合，通过对单基因或相关基因家族的靶序列进行多轮随机诱变、重组和高通量的筛选，可以有效富集正突变，去除负突变，提高突变文库的丰度，创造新基因和获得期望功能的蛋白质。 ＤＮＡ改组的原理 ＤＮＡ改组实际上是依赖于ＰＣＲ的体外诱变技术。 它是将单个基因或相关基因家族的靶序列通过物理或化学方法随机片段化，由于这些小片段之间具有一定的同源性，通过无引物ＰＣＲ和有引物ＰＣＲ组装成全长的嵌合体基因即嵌合体文库。 DNA shuffling技术应用 该技术应用于随机诱变产生或自然发生的同源基因（大约８０％的同源性）变种间的重组，例如，利用该技术已经成功地对枯草杆菌蛋白酶Ｅ基因进行了改组，从突变文库中筛选到８０００个能够进行表达的克隆，其中有３个变种在６５℃的半衰期提高了２５～５０倍。 在废水处理中，由于硝化细菌生长极慢，而且还不能有效地硝化无机氮，因而利用该技术对来源于不同硝化细菌的１５个负责编码亚硝酸盐氧化物还原酶的ｎｏｒＢ同源基因（同源性９８％ ～９９％）进行了改组，筛选到的变种Ｘ１６，同野生型相比，生长速度更快，适