HPLC培训2.ppt

流动相导论 溶剂系统 可以是一种或多种水溶液 或有机溶剂 携带样品流经色谱柱至检测器 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离 选择溶剂需考虑的问题 极性与溶剂强度 纯度、过滤、除气 与其他溶剂的互溶性 缓冲溶液与pH 等梯度或梯度洗脱分析 流动相的要求 ①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。 ②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。 ③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。 ④粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。 ⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。 ⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。 HPLC用水 HPLC用水 HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。 进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。 美国药典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用标准蔗糖溶液1.19 mg/L），电导率在室温pH 6时≤2.4 μS/cm（即≥0.42 MΩ·cm）。HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典纯水≤10ppm）。 选择正确的流动相 合适的流动相 改善分离效果 要求 性质稳定，对色谱柱无影响 与检测器匹配 对样品有很好的溶解性 低黏度、低沸点 纯度高 易得到，价格适中 尽量避免使用有毒溶剂 反相色谱使用的溶剂 多用水作主要的流动相组成 (A) 水极性强、有低的蒸汽压 除极性或离子型溶质外所有疏水性物质均会附着在固定相上造成保留 必须使用色谱级纯水，避免系统污染 污染 调整有机溶剂（作修饰剂） (B) 的浓度 是改变组分保留的主要因素 有三种反相色谱常用的有机溶剂 Acetonitrile, Methanol, THF 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 流动相的准备 配置流动相 混合、除气、过滤 溶剂的混合 每一组成的溶剂在混合前必须分开测量体积再混合 两种溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和 流动相的准备—除气 气泡的形成 空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂 多余的气体将离开溶剂形成气泡 流动相的准备—过滤 将流动相中的颗粒除去 细小颗粒会阻塞色谱柱 影响泵的使用 影响检测器流通池 储液瓶加盖 溶剂进口加过滤头 加预柱保护色谱柱 流动相的准备—添加剂 缓冲溶剂 维持溶液的 pH 至少添加 50-100 mM 需避免加入缓冲集后发生沉淀 抗氧化剂 保护样品和仪器硬件 流动相的准备—pH 值 流动相的pH值 反相离子抑制技术—— 反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。 弱酸样品：流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液 弱碱样品：通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。 注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。 流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。 因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用