1编号：生物农药研究中心[2006-04-03],共3页承担单位：浙江大学.DOCVIP

编号：生物农药研究中心[2006-04-03], 共 3页 承担单位：浙江大学生物技术研究所 课题编号：2002AA244031 课题名称：促生、抗逆、防治病虫的多功能生化-生物制剂的研制与应用 课题负责：陈靠山 子课题名：利用益生细菌进行作物枯萎病生物防治的研究 子课题号： 子课题人：谢关林 刘波 子项目名： 项目主持： 子项目-2： 试验项目：试验人员：郝晓娟试验负责：郝晓娟 报告日期：2006年0月 0日 计数月份：2006.0（） 福建省农业科学院生物技术研究所 生物农药研究中心 电话: 0591 传真: 0591 试验目的 Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。2.1 材料 2.2 方法 DEAE Sepharose Fast Flow： 用20 mmol/L Tris-HCl ( pH8.2 )将柱子完全平衡，上样量为1ml，0-0.5 mol/L NaCl梯度洗脱，流速为0.6ml/min，每管收集3ml，收集60管。琼脂扩散法测定每管收集液的活性。 试验结果 乙醇沉淀经阴离子交换柱层析后，测得4-6管具有抑菌活性。将具有活性的部分收集，聚乙二醇浓缩后，SDS检测。结果如图所示。泳道1为蛋白Marker（4.1-66kD）。2为未经过柱处理的乙醇沉淀。3为经过阴离子柱后收集的具有活性的部分。从3可知，乙醇沉淀过DEAE柱后，完全除去了分子量为20kD以上的蛋白，但同时出现了2中所没有的条带，推测是大分子在过柱是发生分解所至。 图1 SDS检测结果 4. 试验结论 从目前的试验结果推测，在JK-2乙醇沉淀中起主要作用的是分子量为14kD左右的肽。下一步试验思路：将过DEAE柱后有活性的部分收集、浓缩，凝胶层析，按分子量将剩余的蛋白分开，通过检测收集活性成分，冷冻干燥得到纯品。用HPLC与短杆菌肽标样进行对比，测定JK-2菌株产生的抗菌肽是否与已报道的短杆菌肽相同。现在遇到的问题是，该结果在重现两次后，变得无法重复。可能试验条件还需要进一步优化。 参考文献 试验设计：郝晓娟 试验负责：郝晓娟 试验人员：郝晓娟 3