三代基因组测序技术原理简介幻灯片.PDFVIP

三代基因组测序技术原理简介 1 摘要：从1977年第一代 DNA测序技术（Sanger法） ，发展至今三十多年时间，测序技术已取得 了相当大的发展 ，从第一代到第三代乃至第四代 ，测序读长从长到短 ，再从短到长。虽然就当前形势 看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置 ，但第三和第四代测序技术 也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究 ， 药物研发 ，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做 一个简单的小结。 图1 ：测序技术的发展历程 生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是 自沃森和克里克在1953年建立 DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。 第一代测序技术 第一代 DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法 或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解 ）. 并在 1 1977年 ，桑格测定了第一个基因组序列 ，是噬菌体X174的 ，全长5375个碱基 。自此，人类获得 了窥探生命遗传差异本质的能力 ，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实 践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其 测序基础 ，Sanger法核心原理是 ：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基 ，其在 DNA的合成过程中 不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断 DNA合成反应，在4个 DNA合成反应体系中分别加入一 定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为 ：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳 和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的 DNA序列（图2）。这个网址为sanger测 序法制作了一个小短片，形象而生动。 值得注意的是 ，就在测序技术起步发展的这一时期中 ，除了Sanger法之外还出现了一些其他的 测序技术 ，如焦磷酸测序法、链接酶法等。其中 ，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用 2–4 2,4 的测序方法 ，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法 ，但他们的共同核心 1 手段都是利用了Sanger 中的可中断DNA合成反应的dNTP。 图2 ：Sanger法测序原理 第二代测序技术 总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999% ，但其 测序成本高 ，通量低等方面的缺点 ，严重影响了其真正大规模的应用。因而第一代测序技术并不是最 理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进 ，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa ， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。第二代测序技术大大降低了测 序成本的同时 ，还大幅提高了测序速度 ，并且保持了高准确性 ，以前完成一个人类基因组的测序需要 3年时间 ，而使用二代测序技术则仅仅需要1周 ，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很 。 5 表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较 ，以下我将对 这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。 图3. 测序成本的变化 1. Illumine Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器 ，这两个系列 2,4 的技