第七章 电泳技术.pptVIP

7.1 概述 7.1.3 迁移率（mobility, m） 7.1.4 影响蛋白质电泳速度的内在因素 蛋白质分子所带电荷的电性和电量 电性决定电泳方向；电量越大，迁移速度越快 蛋白质分子的大小和形状 分子质量越小、形状越接近球形，在电场中迁移速度越快 7.1.5 影响蛋白质电泳速度的外在因素 溶液pH 决定蛋白质所带电荷的电性和电量 溶液的离子强度 越低，迁移越快；一般应 在0.01~0.2 mol/L之间 电场强度 电渗现象 电泳支持介质 温度 7.1.6 蛋白质电泳的分类 按分离原理的不同 ① 移界电泳 在自由溶液中迁移，引起界面移动。最早，已被取代 ② 区带电泳 在介质中迁移，分离成独立区带。目前最常用 ③ 稳态电泳 迁移到一定时间后达到稳态。如等电聚焦电泳 按有无固体支持物 ①自由电泳 无支持物，如移界电泳、某些等速电泳、 柱电泳 ②支持物电泳 有支持物，如聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂 糖凝胶电泳、等电聚焦电泳等 常用的电泳技术 ① 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳 （常规PAGE） ② 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） ③ 等电聚焦 （isoelectrofocusing，IEF） ④ 双向电泳 （2-D electrophoresis，2-DE） ⑤ 转移电泳 （westerning blotting，Wb） ⑥ 免疫电泳 （immunoelectrophoresis，IE） ⑦ 毛细管电泳 （capillary electrophoresis，CE） 7.1.7 电泳仪器 基本设备：电泳仪、电泳槽、制胶模具 配套设备：冷却装置、凝胶扫描仪、凝胶干 燥器等 电泳按设备形式的不同分为： ① 垂直板式电泳 ② 平板式电泳 ③ 转移电泳 ④ 双向电泳 ⑤ 垂直柱式电泳（盘状电泳） 7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） PAGE（polyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的一种电泳方法 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺单体为材料，甲叉双丙烯酰胺为交联剂，在催化剂作用下，把丙烯酰胺单体聚合成三维网孔结构的高分子聚合物 一、基本原理 （一）聚丙烯酰胺凝胶的合成 1. 丙烯酰胺(Acr) 和甲叉双丙烯酰胺(Bis)量的确定 凝胶的孔径大小由Acr和Bis在凝胶中的总浓度(T)及Bis占两者的百分含量(C，即交联度)决定 T＝Acr+Bis/v ×100% （v：溶液的体积） C＝Bis/Acr+Bis ×100% 实验表明，当C＝5%时，凝胶筛孔直径最小；大于或小于5%，筛孔直径均变大 目前常采用固定值C＝2.6%或5%，再通过选择不同的T值制备不同浓度的凝胶来分离各种蛋白质混合物 2. 凝胶浓度的选择 根据样品中大部分蛋白质的分子量范围 3. Acr单体的催化聚合原理 两种催化反应类型: 化学催化和光催化 ①化学催化（最常用） 过硫酸铵（AP）作为催化剂 N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED）作为增速剂 ②光催化 核黄素作催化剂， TEMED作增速剂，需光 照和氧分子的参与 PAGE可分为（按是否加入SDS和强还原剂）： 常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 常规PAGE对于蛋白质混合物的分离是基于 ① 不同蛋白质分子量大小的不同； ②不同蛋白质分子形状的不同； ③不同蛋白质所带净电荷的不同。电泳过程中蛋白质能保持天然构象及生物学活性 SDS由于加入了SDS和强还原剂（DTT、β-巯基乙醇），对于蛋白质混合物的分离只基于不同蛋白质分子量大小的不同。电泳过程中蛋白质天然构象被破