生化工程实验课件.pptVIP

生化工程实验 实验一 酸性磷酸酯酶的固定化 一、实验目的 了解酸性磷酸酯酶的作用。 系统地学习酸性磷酸酯酶粗酶液的制备方法。 掌握酸性磷酸酯酶固定化的原理及实验操作技术。 二、实验原理 （一）酶的固定化方法 吸附法：物理吸附法和离子交换吸附法。 共价键结合法 交联法 包埋法 本实验采用的固定化方法——— 物理吸附法 物理吸附法是指将酶通过氢键、疏水作用力或π电子云的亲和力等物理作用吸附到水不溶性的惰性载体上，从而制成的固定化酶的方法。 常用的固体吸附剂包括有机的（如淀粉、纤维素等）和无机的两类（如活性碳、多孔玻璃等）。 固定化效果的评价通过测定酶固定前后的活力并按照相应的公式进行计算确定。 三、实验材料 绿豆芽（用于酸性磷酸酯酶的提取） 活性碳（粉碳） 四、实验仪器 低温冷冻离心机 普通低速台式离心机 恒温水浴箱 722型分光光度计 五、实验试剂 ? pH4.9（ 0.143mol/L）的巴比妥醋酸钠缓冲液 称取4.875gNaAc.3H2O和7.357g巴比妥钠，溶于500ml蒸馏水中。 ? 0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠（称取 0.432 g，溶解于200 ml 蒸镏水中。） ③ 5%的三氯乙酸 ④ 定磷试剂： 按照26%硫酸：蒸馏水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1：2：1：1的溶液体积比配制定磷试剂。 此试剂要现配现用，配好的试剂应呈黄色或黄绿色，如呈棕黄色或深绿色应弃去。 抗坏血酸存放在冰箱内可保存一个月。 六、实验步聚 1、粗酶液的制备 将生长5～7d的绿豆芽去叶和根，用蒸馏水洗涤数次，置吸水纸上吸干表面水分后称取10 g，剪成小段，置研钵中加少量蒸馏水和少许石英砂，置冰盘中研成匀浆。 匀浆于7000 r/min低温离心10 min，取上清液蒸馏水定容到20ml，备用。 2、酶的固定化 称取0.2 g 活性炭（经110℃活化0.5 h），倒入盛有8 ml粗酶液的50 ml低温离心管中，间隙搅动，固定化处理10 min。然后7000 r/min低温离心10 min，沉淀活性炭即为固定化酶，上清液为固定化后的滤液。 3、酶活力的测定 （1）测定滤液、原酶液以及固定化酶的酶活。 酶反应见表1： 七、磷酸标准曲线的制作及使用 制作磷酸标准曲线（下次课作）并根据标准曲线计算酶活。 酶活力单位：在实验条件下，以每分钟释放1umol磷酸所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。 磷酸的含量（μmol）=OD622对应的标准曲线上的磷酸浓度×反应液总体积 总的酶活力=磷酸的μmol数×稀释倍数/10 八、固定化效果的评介 固定化效率=（总的酶活力-剩余酶液酶活性）/总的酶活性 固收率=固定化酶活性/所用总酶液酶活性×100% 九、思考题 固定化效率和回收率说明什么问题？ 吸附法包括哪两种，其原理是什么？ 实验二酸性磷酸酯酶最适pH的测定 一、实验目的 1.掌握酸性磷酸酯酶最适pH的测定方法。 2.认识pH对酶活力的影响。 二、实验原理 实验通过配置一系列不同pH值缓冲试剂，再将酶加入各缓冲试剂中，以维持一定的pH值，再分别加入底物β-甘油磷酸钠，酶使β-甘油磷酸钠催化水解成β-甘油和磷酸氢根离子，反应一定时间后，加入10%的三氯乙酸终止酶促反应。再加入定磷试剂，磷酸氢根离子与定磷试剂反应生成钼蓝，产生的钼蓝在662nm处有最大吸收值，吸光度在一定范围内与无机磷酸的含量成正比，因此可用光密度OD代替酶活性，作出OD—pH曲线，从曲线上可知表现其最高活力时所处的最适pH。 三、实验材料 固定化酸性磷酸酯酶（制备方法同实验一） 四、实验试剂 （1）0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠； （2）0.1mol/L的HCl （3）8.5%的NaCl溶液； （4）10%的三氯乙酸； （5）0.143mol/L的巴比妥—醋酸钠溶液：称取4.875gNaAc.3H2O和7.357g巴比妥钠，溶于500ml蒸馏水中。 （6）系列pH值的巴比妥—醋酸缓冲液：取25ml容量瓶6个，各加入5ml 0.143mol/L巴比妥—醋酸钠溶液和2ml8.5%NaCl溶液，再按下表加入0.1mol/LHCl，摇匀后，用?pH计测定pH值，并用0.5mol/LNaOH调节至所需pH值，最后用蒸馏水定容至刻度。 （7）定磷试剂的配制方法： 按照26%硫酸：蒸馏水：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=1：2：1：1的溶液体积比配制定磷试剂。 此试剂要现配现用，配好的试剂应呈黄色或黄绿色，如呈棕黄色或深绿色应弃去。 抗坏血酸存放在冰箱内可保存一个月。 五、实验步骤 （1）酸性磷酸酯酶和固定化酶的制备 a.酸性磷酸酯酶粗酶液的制备（同实验一） 。 b.固定化酶的制备（同实验一） （2