第一章 沉淀与膜分离.docVIP

高级生物化学（生物化学研究技术） 研究生的特点：“研究”系统性、专一性。 各学科研究的共性：机理的研究(物质基础—蛋白质)，通过机理的研究，使研究者由 一叶障目 不见泰山 一叶知秋(蛋白质种类与含量的变化)。 恩格斯曾说:生命是蛋白质的存在方式,这种存在方式本质上就在于蛋白质化学成分的不断自我更新. 这是:没有蛋白质的存在,也就没有生命生物化学与分子生物学研究技术：生物化学与分子生物学研究技术是研究生物大分子最基本、最重要的技术之一，是生命科学发展过程中必不可少的重要组成部分。生物化学与分子生物学研究技术都是以生物大分子为研究对象，是目前在生物大分子水平上研究的最常用技术。生物化学研究技术是以蛋白质研究技术为主，介绍一些相关生物化学技术如：光谱技术、色谱技术、蛋白质电泳技术、蛋白质测序技术、超离心技术等。分子生物学研究技术是以核酸化学为主介绍一些相关研究技术：如基因构件、分子克隆、DNA测序、核酸电泳等技术。从基因工程或蛋白质工程的角度说分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术，生物化学研究技术称之为基因工程下游技术。前者具有一定的共性，后者具有一定的个性。但是从广义上来说许多技术的分析原理都是相同的，只是在实际应用中各有侧重。 参考书目 1．赵永芳编著，生物化学技术原理及其应用，武汉大学出版社，1995年7月第二版 2． （美）C.W.迪芬巴赫等著，黄培堂等译，PCR技术实验指南，科学出版社，1998年8月第一版，1999年4月第二次印刷 3．（美）F.奥斯伯等著，颜子颖等译，精编分子生物学实验指南，科学出版社，1998年6月第一版 4．杨安钢、毛积芳、药立波主编，生物化学与分子生物学实验技术，高等教育出版社，2001年2月第1版 5. 陈毓荃主编，生物化学实验方法和技术，科学出版社，2008年6月第一版 前序： 要从生物体内获得某一组分进行分析与研究，首先要确定取样对象及其部位！ 一、取样的原则 取样量：能代表研究对象的本质，从自然群体或待研究的群体中取样；样本量小于30份为小样本，大于30则为大样本；研究病例时，可能只有一个样本，难于总结出规律(只能对症医治) 部位：表现研究特征与本质的部位，越精细越好，如：表现特征的部位，缺锌的叶主脉两侧、缺钙的根尖、茎尖等停长坏死。研究癌细胞就要从癌组织中取样。细胞分化常常从某一个细胞或几个细胞开始，所以取样要精细，才能有针对性。 二、提取与分离或制备样品分子 1. 生化分离分为分离分析与分离制备，分离分析即分离各组分，而进行定量与定性鉴定，不一定把某组分从混合物中分离提取出来，如，氨基酸的定性与定量分析。 分离制备则是为获得某一单纯组分。并有活性或生理功能，这与其结构有关，所以，生化分离与化学分离不同，要保证其结构和性质不改变。有如下特点： 成分复杂且时刻在发生代谢变化。要注意时间！ 有的含量很低，用材料多。如，激素、酶等。 离开活体易变性，所以条件要温和，如有的要低温使代谢减慢不变质。 ⑷ 都在溶液中进行，影响因素多，要重复性好，就必须严格规定材料、方法、条件与试剂等。 (5) 纯度鉴定常需多种方法：层析、电泳、染料显色、理化特性分析等。 故生化分离与制备大都根据混合物中不同组分分配率的差别（顺其自然，先试验再总结规律，用于实践），将它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（如有机溶剂抽提油脂、盐析、结晶等沉淀分离蛋白），或将混合物置于某一物相中（多是液相），外加一定的作用力，使各组分分配于不同区域而分离（如电泳、超离心、超滤等）。先介绍溶剂提取、沉淀、膜分离、浓缩与干燥。现代生化分离制备常用沉淀、离心、层析、电泳四大生化基本技术。 第一节 溶剂提取法 利用溶剂的溶解作用，从细胞中提取所需物质，这里影响物质溶解度即影响提取的因素主要有： 1．溶质的性质：如，DNA、RNA易溶于盐溶液中（DNA提取缓冲液（500mM NaCl、100 mMTris·HCl、50mM EDTA），微溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质中清蛋白：溶于水与稀盐溶液；球蛋白不溶于水，溶于稀盐；谷蛋白可溶于稀酸稀碱，但不溶于水…… 2．溶剂的性质，⑴相似相溶原理（极性）。⑵ 酸、碱互溶机制：碱性物质易溶于酸性溶剂中，反之亦然；⑶极性溶剂中，溶解极性物质，溶剂的介电常数减小一些溶质（极性带电）的溶解度就减小。可通过丙酮等沉淀一些蛋白。 3．离子强度：I=1/2ΣCZ2 （Z：离子价数，C：离子的摩尔浓度）高盐中DNA溶解度大，低离子强度下RNA溶解度大，0.14mol/LNaCl 中可溶出RNA，而沉淀DNA(一般以2mol/L氯化钠溶解)。蛋白质在稀盐中，比水中溶解度大，称为盐溶效应，此乃少量离子的活动，减少了蛋白质分子极性基团之间的静电引力，加强了蛋白质与溶剂间的相互作用之故。低盐还