牛、羊成纤维细胞的冷冻与冷藏保存.pdfVIP

V01．24No．2 197 中国兽医学报 2004年3月第24卷第2期C^锄t，y以S矗Mar．2004 牛、羊成纤维细胞的冷冻与冷藏保存 刘 (1．安徽农业大学畜牧水产学院， 亚1，章孝荣H，张运海1，金仁桃1，章美玲1，汪存利1，吴集义2 、 安徽合肥230036；2．安徽省休宁县兽医站，安徽休宁245400) 摘要：以体外培养的布尔山羊和黄牛耳组织成纤维细胞为研究对象，进行了哺乳动物体细胞的冻存与冷藏试验。结果 7表明，牛、羊的耳成纤维细胞在液氮中冻存48h或冷藏19d(4‘C)后再接种培养，仍能正常贴壁与生长。本试验筛选出 一种简单易行的细胞冻存方案。 关键词：成纤维细胞；细胞冷藏；细胞冷冻 中图分类号：S852．16 文献标识码：A 文章编号：1005—4545(2004)02一0197一02 体细胞的体外培养是动物克隆过程的重要一环，但由于 哺乳动物体细胞在体外的生存期一般不超过1年uj，而且还 mL细胞冻存 可能因频繁传代而增加染色体变异的机率[2]。因此在常规培 后分别装入国产(押一12)和进口(咒一6)的1．8 养条件下同一批次的细胞很难长期保存，但若采取适当的方 管中及无菌国产1mL塑料离心管中(咒一6)。将采用国产和 法将细胞在超低温条件下保存，即可使其生命活动固定在某 进口DMS0作为冷冻保护剂的细胞样品分别分为3组，每组 一阶段而不衰老死亡[2]，对哺乳动物的克隆研究具有非常重 4只，分别采用3种不同程序进行冷冻。 要的价值。目前，在哺乳动物体细胞核移植试验中，普遍采用 1．4．2冷藏8d的细胞的冻存将含不同血清浓度的冷藏 的方案是在显微操作之前1～2h对培养的供体细胞消化脱 细胞经离心后弃上清，然后分别加入含20％FBs和10％ 壁，或从新鲜的组织上临时分离，很多研究者在显微操作之前 5～8 d就对供体细胞进行特别处理(如血清饥饿法)，这些工 液，经吹打混匀后分别分装入国产(，z一4)和进口(n一4)的 作既烦琐，又增加了细胞变异的机率。本试验以山羊和牛耳成 1．8 mL细胞冻存管中及无菌国产1mL塑料离心管中(”一 纤维细胞为材料进行了哺乳动物体细胞的冷冻与冷藏研究， 4)，按程序一冻存。 旨在建立简便的细胞冷藏和冷冻保存方法，简化体细胞核移 1．4．3冷冻程序采用3种程序进行细胞冻存试验。 植程序。 程序一：将装存细胞的冻存管或离心管(”=12)在4℃冰 箱中平衡30～40min，然后置于荷包中放入液氮罐内，使冻 1 材料与方法 存管在距液氮面5～10cm处平衡2h，然后将冻存管投入液 1．1 细胞 为传至第2、3、4代的牛耳成纤维细胞及第2代氮内。 的布尔羊成纤维细胞。 程序二：将装有细胞的冻存管或离心管(，z一12)在4℃冰 1．2试剂与器材 箱中平衡30～40min，然后置于荷包中放入液氮罐内，使冻 No．sH30042．存管在液氮面(将荷包缓慢下放，以刚听到荷包底部接触到液 1．2．1 试剂 O．25％胰蛋白酶溶液(CAT 氮面时而发出“兹兹”声为准，停止下放荷包)平衡1h，然后将 01)、DMEM／F12(1：1)培养液(CatNo．SH30023)，均购自