松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制论文.docVIP

　　松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制论文 【摘要】 目的 研究松花粉对衰老成纤维单细胞面积、β半乳糖苷酶染色(SAβgal)阳性率、p16INK4A和p21CIP1表达以及细胞周期的影响。方法 以二倍体成纤维(2BS)细胞建立衰老细胞模型。生物体视学法分析单细胞面积变化;免疫组化法测SAβgal阳性率;流式细胞术分析细胞周期;RTPCR法测定p16INK4A、p21CIP1基因mRNA表达量。结果 56代细胞出现典型的衰老细胞形态改变，同时SAβgal染色阳性率与G1期细胞比例均增高。经松花粉处理后，衰老细胞的单细胞面积、SAβgal染色阳性率与G1期细胞比例均显著减少(P 0.05);p16INK4A与p21CIP1mRNA的表达量均较衰老模型组明显下调(P 0.05)。 结论 松花粉具有改善细胞复制性衰老的作用，其分子机制可能与下调p16INK4A及p21CIP1基因mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关。 【关键词】 细胞衰老;松花粉;生物体视学;细胞周期;P16;P21 【Abstract】 Objective To observe the effect of pine pollen on the surface area of single cell, the positive rate of senescenceassociated (SA)βgalactosidase stain, the expressions of p16INK4A and p21CIP1 and the phase of cell cycle in 2BS cells. Methods The model of aging cell ade by 2BS cells. The surface area of single cell in each groups ethod of biological stereology, the positive rate of SAβgalactosidase stain ined by immunohistochemistry，the phase of cell cycle easured by floetry, and the expressions of p16INK4A,p21CIP1mRNA ent of pine pollen, the surface area of single cell, positive rate of SAβgal and the rate of the phase of G1 RNA olecular mechanism may be related RNA and then improving the G1 phase blocking. 【Key tDNA4977在衰老细胞的突变率;提高衰老细胞端粒酶活性〔2〕。本实验以衰老细胞的单细胞面积、β半乳糖苷酶染色(SAβgal)阳性率及细胞周期等指标对衰老细胞模型进行检测，选取p16及p21作为细胞衰老的分子检测指标，探讨松花粉通过作用于细胞内在基因调控机制抗衰老的可能性。 1 材料与方法 1.1 细胞培养、分组与处理 人胚肺2BS细胞由北京生物制品研究所建株，27代引入。细胞寿限为60～70代。2BS细胞以含15%胎牛血清的MEM培养基于37℃,5%CO2温育箱中。至30代时随机取8瓶作为年轻对照组，至56代随机取24瓶分成3组即：衰老模型组、松花粉中、高剂量组，每组8瓶，分别以单纯完全培养基，120与240 mg/dl的含花粉血清培养基培养8 d〔2〕，收集细胞。参照文献〔3，4〕配制松花粉血清液，使其终浓度分别为120与240 mg/dl。 1.2 仪器与试剂 FACScan 流式细胞仪(Beckman coulter);CMIAS病理图像分析系统(北航);PCR仪(ABI 9700);凝胶成像仪(BioRad)。类标准胎牛血清(FBS)购自民海生物，MEM培养基(含非必需氨基酸、谷胺酰胺)为Invitrogen产品。细胞衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒(上海杰美);cDNA试剂盒(Invitrogen，superscript Ⅲ逆转录试剂盒);流式细胞周期检测试剂盒(上海杰美)。 1.3 细胞形态观察及单细胞面积测定 各组细胞相差显微镜下观察形态改变(×100)。同时每瓶细胞高倍镜下随机取5个视野拍照(×400)。采用CMIAS软件获得各组单细胞平均表面积值(μm2)。 1.4 细胞衰老相关β半乳糖苷酶(SAβGal)染色 取每组细胞各1瓶，去培养液，以PBS冲洗两遍，按细胞SAβGal染色试剂盒说明染色后置于37℃,5