DNA琼脂糖凝胶电泳分析.pptVIP

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳 主讲人：文琪 同组人员：黄梦秋 张如骐 肖重科 实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。 实验原理 DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。 在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验器材和试剂 实验器材： 桥是平板电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪 样品： DNA分子量标准品，质粒 试剂 琼脂糖 1×电泳缓冲液（TBE） 6×上样缓冲液 溴化乙锭(EB) ：10mg/ml 上样缓冲液 0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液 作用： ①增加样品密度，使其比重增加，以确保DNA均匀沉入加样孔内 ②在电泳中形成肉眼可见的指示带，可预测核酸电泳的速度和位置 ③使样品呈色，使加样操作更方便 琼脂糖凝胶 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。 此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。 电泳指示剂： 核酸电泳常用的指示剂有两种 溴酚蓝（ bromophenol blue, Bb ）； 二甲苯青（ xylene cyanol, Xc ），它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢 核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出桔红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。 （注意：EB被认为是一种强致癌物质，操作时应尽量小心，配置和使用EB时都应带上手套，且注意不要把EB洒到桌面或地板上。 ） 银染色 影响琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大 琼脂糖凝胶的优点 (1) 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。 (2)琼脂糖凝胶结构均匀，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。 (3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外监测及定量分析。 (4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。 缺点： 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 银染色 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染成黑褐色。 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色。 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不宜回收 实验操作 制备琼脂凝胶 胶板的制备 加样 电泳 紫外透射仪检测 操作步骤 1. 准备 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子 2. 配制1%琼脂糖凝胶及倒胶 具体步骤： 三角瓶内：0.6g琼脂糖 +60ml(0.5×TBE) 煮胶溶解 冷却至60℃(不烫手) 加EB 倒板 室温下充分凝固 垂直向上拔出梳子 将胶板放入电泳槽 向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1~2nm。 3. 加样 将DNA样品（5ul）与6 ×上样缓冲液（1ul） 混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内。 注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。 每加完一个样品要