细菌的革兰染色法、芽孢染色法.pptVIP

实验二、细菌的革兰氏染色、芽孢染色 一、实验目的： 掌握细菌芽孢染色和革兰氏染色的方法 初步掌握无菌操作技术； 掌握细菌芽孢染色和革兰氏染色反应原理、巩固油镜的使用。 二、实验原理 1、革兰氏染色法 1884年由丹麦病理学家C.Gram创立。革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。 革兰氏染色的机理： 主要由于两类细菌的细胞壁成分{肽聚糖（不溶于乙醇）和脂类（溶于乙醇）}和结构{肽聚糖层的交联程度及厚度}不同而造成的。 革兰氏阳性菌肽聚糖含量高（90％）交联程度高，肽聚糖层厚（用乙醇不易脱色） 革兰氏阴性菌肽聚糖含量低（10％）交联程度低，肽聚糖层薄（用乙醇易脱色）。 * * 芽孢 又称内生孢子（endospore），是某些细菌（革兰氏染色阳性杆菌）生长到一定时间（对数期后期），在细胞内形成一个圆形、椭圆形或圆柱形的结构。 2、芽孢染色 芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节（休眠体），它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。 中央芽孢 偏端芽孢 游离芽孢 末端芽孢 芽孢染色原理 芽孢壁厚、透性低，着色和脱色均较困难，当用弱碱性染料（孔雀绿）在加热的情况下进行染色时，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内， 进入菌体的染料经水洗后被脱色，当用对比度大、浅色的复染色剂（番红液）染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，使芽孢和菌体更易区分。菌体呈红色而芽孢呈绿色。 1、菌种：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（1号—培养12h，用于革兰氏染色；2号—培养18h，用于芽孢染色），培养24小时的大肠杆菌（Escherichia coli）用于革兰氏染色。 2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%酒精、番红染液、5％孔雀绿水溶液、生理盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。 三、实验器材 1、革兰氏染色 制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→观察 四、实验方法 革兰氏阴性杆菌 革兰氏阳性杆菌 1、载玻片要洁净无油迹。涂片时，滴生理盐水不要过多，挑菌量宜少，涂片要均匀，菌膜宜薄。 2、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。 3、染色过程中勿使染色液干涸。 4、选用幼龄的细菌。 ？ 注意事项 革兰氏染色程序和结果 步骤 方法 结果 阳性（G+） 阴性（G-） 初染 结晶紫30s 紫色 紫色 媒染剂 碘液30s 仍为紫色 仍为紫色 脱色 95％乙醇30s 保持紫色 脱去紫色 复染 番红（或复红）30～60s 仍显紫色 红色