酶联免疫吸附实.ppt

一、实验目的 1.掌握酶联免疫吸附试验的基本方法及原理 2.掌握酶联免疫吸附试验结果的观察与判断 3.了解ELISA在微生物检测中的应用 二、实验原理 抗原或抗体结合到固相载体的表面仍保持其活性 抗原或抗体与酶交联成酶标抗原或抗体后，仍保持其免疫活性和酶活性 标本中的抗原或抗体、标记抗原或抗体能按一定的次序与固相载体表面的抗原或抗体反应，并通过底物与酶的反应来反映标本中的抗原或抗体的量 三、实验材料 1.器材 1）酶联免疫检测仪 2）12联孔聚苯乙烯条 3）37℃温箱 4）微量加液器及移液器头 2.试剂 1）包被液 2）pH7.4磷酸盐缓冲液 3）洗涤液 三、实验材料 2.试剂 4）封闭液： 5）酶标抗体稀释液 6）底物液 7）终止液 8）未知抗原 9）HRP羊抗兔血清： 四、实验步骤 1、稀释未知抗原：用pH9.6 0.05M碳酸缓冲液将抗 原稀释至 2、包被未知抗原：在聚苯乙烯板的反应孔中，各 加入不同稀释倍数的抗原0.1 ml， 以不加抗原 的两孔为对照，置于4℃冰箱过夜或37℃2小时 四、实验步骤 3、洗涤 ：快速甩动12联孔条，倒出孔内包被液， 之后在每小孔加入 洗涤缓冲液，室温静 置放3min，甩出洗涤缓冲液，重复三次。最后 把反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽 4、封闭：每小孔加封闭液 5、洗涤：同上 6、加酶标抗体：各孔中加入新配制酶标记抗体 四、实验步骤 7、洗涤：同上 8、加底物显色：各反应孔中加底物溶液 9、终止反应 ：待有颜色反映时，于各反应 孔加 入 终止液 10、比色：在酶标仪上，于450nm读取A或 OD值 五、实验结果 1. 肉眼观察：空白对照与阴性对照孔为无色或接近 2. 结果及判定 * * 实验一 酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 过程：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体, 再加相应酶标记抗体，生成抗原--待测抗体--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。 常用的ELISA方法包括：间接法、双抗体夹心法、竞争法等。 3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）； ②酶标记的抗原或抗体（标记物）； ③酶作用的底物（显色剂）。