rsky重组蛋白的原核表达，初步纯化及鉴定.docVIP

重组蛋白rSKY的原核表达、初步纯化及鉴定 摘 要：本文对先前构建的菌株E.coli BL21/pET30a-SKY进行鉴定，判断rSKY是否表达及表达方式。结果表明经过诱导，E.coli BL21/pET30a-SKY可成功表达rSKY，且为可溶性表达。将菌的蛋白粗品70℃加热20分钟，可除去大部分非目的蛋白，rSKY得到有效纯化。 关键词：rSKY 原核表达 鉴定 RSKY recombinant protein of the original nuclear expression, preliminary purification and identification Abstract:In this experiment, On previous strains of building up the E.coli BL21 / pET30a-SKY evaluations.then Judge whether rSKY express and expression.The results show that after the induction, E.c oli BL21 / pET30a-SKY can be successful rSKY expression, and to soluble expression.Will the bacteria protein crude products 70 ℃ heat 20 minutes,it can remove most of the nontarget protein, rSKY effectively purification. Key words: rSKY original nuclear express identification 前言：SKY是一种耐热蛋白酶，实验室先前克隆到sky基因，构建了原核表达载体pET30a-SKY，测序正确后将其转化E.coli BL21感受态，并筛选了阳性克隆。本实验将对所构建质粒的表达情况及纯化方法进行进一步研究。 1材料与方法 1.1试剂与仪器 LB液体培养基：1L溶液中含10g蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl, pH7.3。 LB固体培养基：1L LB液体基本中加入15g琼脂。 提取缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl，pH7.3。 试剂均为国产分析纯 E.coli BL21/pET30a-SKY为本实验室构建保存的菌株。将E.coli /pET30a-SKY在LB固体培养基平板上划线。挑取单菌落接种于5 ml LB培养液(含25 mg/ml Kan)中,37 ℃，200 rpm恒温震荡培养OD600=0.5-0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L， 37 ℃继续培养4 h，8 000 rpm 离心10 min收集菌体。E.coli BL21/pET30a作为对照组。 1.2.2 蛋白粗品的制备 将收集的菌体用0.5 mL提取缓冲液悬起，超声破碎后，12 000 rpm离心30 min，取上清。mol/L尿素溶解。 1.2.3 重组蛋白rSKY的初步纯化 取0.025 mL1.2.2制备的上清于70 ℃水浴中加热20分钟，12 000 rpm离心30 min，取上清。Laemmli[1]的方法进行。浓缩胶浓度4%，分离胶浓度12.5%，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V，使用考马斯亮蓝R-250染色。1 2 3 4 5 前五道分别为 1. E.coli BL21/pET 30a表达的沉淀；2. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的沉淀；3. E.coli BL21/pET30a表达的上清；4. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的上清；5. E.coli BL21/pET30a-SKY表达的上清70 ℃ 水浴中加热20分钟后的样品。 2.2 由E.coli BL21/pET30a-SKY比E.coli BL21/pET30a的上清明显多出一条带，判断rSKY在构建的菌株里有表达且为可溶性表达。 2.3 由加热后的上清中目的蛋白rSKY保留，杂蛋白很少，表明用加热的方法可对rSKY进行有效纯化。这种热稳定蛋白结构及功能上的特性赋子其良好的 热稳定性和内蛋白水解酶抗性，能够经过发芽、糖化及煮沸发酵等过程后仍然得以保存，成为决定啤酒的口感风味、泡沫及胶体稳定性等品质指标。[3] 2.4本实验成功构建了pET30a-SKY原核表达载体。表达载体在E.coli BL21中高效表达，获得rSKY重组蛋白。实验进一步证明该蛋白表达为可溶性表达。将菌的蛋白粗品70℃加热20分钟，可除去大部分非目的蛋白，r