第一章 SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量.docVIP

SDS电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。实验原理??? SDS电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。 3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： ???????????????????? 1gMr =K―bmR式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；直流稳压电源；50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。原料：低分子量标准蛋白质按照每种蛋白0.5~1mg·ml-1样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。试剂：（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。?（3）30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr） 30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4保存。（4）10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。（5）10%SDS溶液：SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（6）1%TEMED；（7）10%过硫酸铵（AP）：现用现配。（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。（9）样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。（10）染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。（11）脱色液：75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。实验步骤1．安装夹心式垂直板电泳槽：目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。同学们可根据具体不同型号要求进行操作。主要注意：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；勿用手接触灌胶面的玻璃。2．配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。本实验采用SDS不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。 试剂名称 配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml 配制10ml浓缩胶所需试剂用量 5% 7.5% 10% 15% 3% 分离胶贮液 （30%Acr-0.8%Bis) 3.33 5.00 6.66 10.00 - 分离胶缓冲液 （pH8.9Tris-HCl） 2.50 2.50 2.50 2.50 - 浓缩胶贮液 （10%Acr-0.5%Bis） - - - - 3.0 浓缩胶缓冲液 （pH6.7 Tris-HCl） - - - - 1.25 10% SDS 0.20 0.20 0.20 0.20 0.10 1%TEMED 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 重蒸馏水 11.87 10.20 8.54 5.20 4.60 混匀后，置真空干燥器中，抽气10min 10%AP 0.10 0.10 0.10 0.10 0.05 3．制备凝胶板：（1）分离胶制备：按表配制20ml 10%