in介导的重组人ARDBD的原核可溶性表达、纯化和活性鉴定.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（４）：７１１ Ｉｎｔｅｉｎ介导的重组人ＡＲＤＢＤ的原核可溶性表达、 纯化及活性鉴定 １ １ ２，３ 姚广新 　张怡轩 　胡双纲 （１沈阳药科大学　 沈阳　１１００１６　２中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所　上海　２０００３１） （３分子生物学国家重点实验室　上海　２０００３１） 摘要　雄激素受体通过ＤＮＡ结合域与效应元件结合发挥作用，在以往的研究中多采用与 ＧＳＴ或 ＰｒｏｔｅｉｎＡ融合的方式对雄激素受体的ＤＮＡ结合域（ＡＲＤＢＤ）进行重组表达，但获得无融合标签 的纯ＡＲＤＢＤ的操作非常繁琐。现借助内含肽介导的自剪切作用经一步亲和层析得到纯度较高 的无融合标签的ＡＲＤＢＤ，以利于对其性质和功能的研究。通过 ＰＣＲ方法扩增了编码人雄激素 受体５２０～６４４位氨基酸的核苷酸序列，将该序列克隆入 ｐＴＷＩＮ１融合表达载体，转化大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）后对诱导温度及ＩＰＴＧ浓度进行优化，重组蛋白几乎全部可溶表达。将可溶性部分吸 附到几丁质亲和层析柱上，通过ｐＨ诱导的内含肽自剪切作用释放出不含融合标签的重组人 ＡＲ ＤＢＤ蛋白，凝胶阻滞分析证明该蛋白只特异性结合保守的雄激素响应元件（ＡＲＥ），具备正常的生 物学活性。 关键词　雄激素受体　ＤＮＡ结合域　内含肽 中图分类号　Ｑ７８６ 　　雄激素受体（ａｎｄｒｏｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＡＲ）是一种转录因 多克隆及单克隆抗体制备等。而这些领域的研究用到 子，属于核受体超家族成员。当被其配体———雄激素 的ＡＲＤＢＤ蛋白，多是采用基因工程菌表达的重组蛋 激活后，便进入靶细胞的核内，以高专一性、高亲和力 白。目前已有多篇应用重组ＡＲＤＢＤ进行相应研究的 与雄激素响应元件（ａｎｄｒｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ，ＡＲＥ）结 ［５９］ 报道 ，但普遍存在的一个问题是这些重组蛋白均为 ［１３］ 合从而调控靶基因转录 。与该家族其他成员相似， 融合表达的蛋白，在有些研究中融合标签对 ＡＲＤＢＤ ＡＲ包含 Ｎ端转录激活域 （ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ 所造成的影响不可忽视，而要去除融合标签一般都要 ｄｏｍａｉｎ，ＴＡＤ），ＤＮＡ结合域 （ＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ， 经过蛋白酶切和再纯化的过程，导致蛋白质活性和产 ＤＢＤ）和Ｃ端配体结合域（ｌｉｇａｎｄｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＬＤＢ） 率下降，而且用于酶切的蛋白酶价格也非常昂贵。针 ［４］ ３个主要功能域 。其中的ＤＢＤ在ＡＲ对ＡＲＥ的特异 对这些问题，我们采用ｐＴＷＩＮ１载体对ＡＲＤＢＤ进行重 性识别与高亲和力结合过程中发挥着主要作用，因此 组表达，将载体 自身的几丁质结合结构域 （ｃｈｉｔｉｎ 对ＡＲ正常功能的发挥是必不可少的。 ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ，ＣＢＤ）以及集胞藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓｓｐ） 　　为了更透彻的阐明ＡＲ对ＡＲＥ特异性识别与结合 ｄｎａＢ基因内含肽（ｉｎｔｅｉｎ）与ＡＲＤＢＤ融合，可实现重组 的分子机制，研究者们对ＡＲＤＢＤ展开了广泛的研究， 蛋白的一步纯化，不但操作简单方便，也在很大程度上 如ＡＲＤＢＤ的三维结构，ＡＲＤＢＤ与ＡＲ其它结构域的 保证了重组蛋白的活性和产量。 相互作用，ＡＲＤＢＤ内对其功能发挥关键作用的氨基 酸，与ＡＲＤＢＤ结合的ＡＲＥ序列及其特性，抗ＡＲＤＢＤ １　材料与方法 收稿日期：２０１１０１０７　　修回日期：２０１１０１２７ １．１　材　料 国家自然科学基金资助项目 　　含有人ＡＲ全长ｃＤＮＡ序列的载体ｐｃＤＮＡ３．０ＡＲ 通讯作者，电子信箱：ｓｈｕａｎｇｇａｎｇｈｕ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ