桑树MSR、CDPK和GALK基因的克隆及诱导表达分析.pdfVIP

学 号： 092300013 文 摘： 桑树是一种重要的经济作物，并且我国拥有世界上最为丰富的桑树种质资源。但 是许多病虫害和各种逆境条件往往会对桑树的产量造成重大影响。因此，研究桑树一 些重要的功能基因及其在胁迫条件下的分子作用机制，可以增强桑树对各种胁迫条件 的抗逆性，对提高桑叶产量和桑树种质资源的保存具有重要意义。然而，与其他作物 相比，我们对桑树功能基因的研究至今还处于起步阶段，对桑树的一些功能基因及其 编码的蛋白质的功能仍然不甚了解。因此，开展桑树功能基因的研究是一项紧迫而有 意义的工作。 本文从已构建的桑树幼叶cDNA 文库中获得了3 个ESTs 序列，并根据这三个已 知的ESTs 序列设计相关的特异性引物，结合RT-PCR 和RACE 技术克隆得到了这 3 个基因的完整cDNA 序列，并对获得的全长序列进行了结构分析和功能预测，利用胁 迫诱导和半定量的方法对这3 个功能基因进行了功能验证。本论文针对这3 个基因所 做的主要研究内容如下： 1、桑树甲硫氨酸亚砜还原酶基因的克隆、序列分析及诱导表达研究 从已构建的桑树幼叶 cDNA 文库得到了一个编码桑树甲硫氨酸亚砜还原酶 (methionine sulfoxide reductase)基因的一段序列，通过RT-PCR 首次获得了这个基因的 完整序列，并将其命名为M-MSR （GenBank 登录号：JQ031782 ）。序列分析表明，该 基因序列全长810bp，存在44bp 的5’端非翻译序列（5’-UTR ）和181bp 的3’端非翻译 序列（3’-UTR ），其开放读码框（ORF ）长585bp，编码194 个氨基酸，预测蛋白质分 子质量为21.60KD ，等电点为6.78 。同源分析表明，桑树M-MSR 基因与杨树、草莓和 蓖麻等各物种间具有很高的保守性。基于桑树和其它物种MSR 基因的系统进化分析表 明，桑树与草莓、葡萄、大豆、拟南芥的亲缘关系较近。半定量RT-PCR 检测表明， M-MSR 在芽中表达量最高，在木质部和幼叶中表达量较低，说明M-MSR 在桑树不同 部位的表达存在一定的差异性。与正常生长环境相比，M-MSR 基因 mRNA 的转录水 平在低温、干旱、高盐胁迫条件下均有所增加。该研究为今后转基因植物抗病工程方 面打下了良好的基础。 2 、桑树钙依赖性蛋白激酶基因的克隆、序列分析及诱导表达研究 从已构建的桑树幼叶 cDNA 文库得到了一个编码桑树钙依赖性蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase)基因的一段序列，通过RACE (rapid-amplification of cDNA ends) 与 RT-PCR 结合的方法首次获得了这个基因的完整序列，并命名为 M-CDPK （GenBank 登录号：JQ066764 ）。序列分析表明，M-CDPK 全长2249bp ，包 含381bp 的5’端非翻译序列（5’-UTR ）和269bp 的3’端非翻译序列（3’-UTR ），其开 放阅读框（ORF ）长1599bp ，编码532 个氨基酸，预测蛋白质分子质量为59.96KD ， 等电点为6.84 。同源分析表明，桑树M-CDPK 基因与烟草、陆地棉、草莓等各物种间 具有很高的保守性。基于桑树和其它 19 个物种 CDPK 基因的系统进化分析表明，桑 树与拟南芥、拟南芥亚种、蓖麻、杨毛果的亲缘关系较近。半定量RT-PCR 检测表明， 幼芽表达量最高，在根和凋萎花中表达量较低，而在成熟果中几乎不表达，说明 M-CDPK 在桑树不同部位的表达存在一定的差异性。与正常生长环境相比，M-CDPK 基因mRNA 的转录水平在低温、盐胁迫条件下均有所下降，这可能是实验得到的只是 CDPKs 基因家族的一个基因，该基因所具有的特性还有待进一步研究。该研究为今后 对桑树中CDPKs 基因家族中相关基因的研究提供了一定的借鉴意义和参考价值。 3. 桑树半乳糖激酶基因的克隆、序列分析和诱导表达 从已构建的桑树幼叶 cDNA 文库得到了一个编码桑树半乳糖激酶(galactokinase) 基因的一段序列，通过RT-PCR 和RACE (rapid -amplification of cDNA ends)结合的方法 首次获得了这个基因的完整序列，并命名为M-GALK （GenBank 登录号：JQ041908 ）。 序列分析表明，该基因全长 1400bp ，存在53bp