葡萄糖和醛固酮对心脏成纤维细胞增殖的影响.pdfVIP

综j苤……………………………………………………………………………………………………29 致谢……………………………………………………………………………………．．37 个人简历……………………………………………………………………………．．38 中文摘要 葡萄糖和醛固酮对心脏成纤维细胞增殖的影响 摘 要 目的：肾素．血管紧张素．醛固酮系统似乎参与啮齿类动物的心脏纤维 化过程，表现为非上皮细胞的增殖和细胞外基质的改变，且在许多实验研 究中高浓度葡萄糖同样可以促进心脏成纤维细胞的增殖。但高浓度葡萄糖 和醛固酮对心脏成纤维细胞的增殖是否具有协同作用，结论并不一致。因 此本研究以新生SD大鼠的心脏成纤维细胞为模型，研究不同葡萄糖浓度 和醛固酮对新生大鼠心脏成纤维细胞增殖的影响．，为心脏纤维化的发生提 供新的认识。 方法： 1实验动物：出生1．3d的SD大鼠，雌雄不限，购于河北医科大学 动物动中心。 2心脏成纤维细胞的培养：无菌条件下取出生1．3天的SD大鼠心脏， 胰蛋白酶消化心脏组织后取消化液，经过滤、离心将所得细胞种植于含培 养液的培养瓶中，将培养瓶放在5％c02、37℃培养箱孵育40分钟后，弃 去上层培养液和未贴壁细胞，所得细胞基本为成纤维细胞。更换培养液， 继续培养，每隔一天换培养液．当细胞生长至亚融合状态时，以lxl05／ml 密度传代，实验所用细胞均为第二代细胞。 3免疫组织化学观察：取24孔板，每孔内放一片盖玻片，将心脏成 纤维细胞接种于孔内盖玻片上，置培养箱内培养。细胞充分附着贴壁后， 取出盖玻片用PBS液清洗两遍，4％多聚甲醛固定，按免疫组织化学染色 采用链霉亲合素一生物素一过氧化物酶(ABC)法进行免疫细胞化学染色 并于显微镜下观察。 4实验分组：将生长状态一致、处于对数生长期的第二代细胞随机分 为九组： mmol／L (1)低糖组(5．6 D．葡萄糖) (2)低糖+10‘7mol／L醛固酮(Ald)组 (3)低糖+10。7mol／LAid+106moFL螺内酯(spi) mmol／L (4)高糖A组(1513-葡萄糖) 中文摘要 (5)高糖A+10。7mol／LAld组 O—m01／LAid+10。6mol／L (6)高糖A+1 Spi mmol／L (7)高糖B组(25D．葡萄糖) 0。7tool／L (8)高糖B+1 Aid组 0。7mol／LAld+10。6mol／L (9)高糖B+1 Spi 各组的培养液均为无血清等渗培养液。 5Brdu、WST-1 ELISA法同步测定心脏成纤维细胞的DNA合成和代 谢活性： 将生长良好的第一代细胞消化、收集、记数，调整浓度后接种于96 弃去各孔培养液，以无血清低糖DMEM培养液培养24小时，使细胞进 mmol／L，15 入静止生长期。采用三种D．葡萄糖浓度培养液(5．6 mmoFL， 25 其中用L．葡萄糖调节三种培养液使其渗透压相等。按试剂盒说明书采用 6统计学处理： (；4-J)表示。多组均数比较采用单因素方差分析，组与组之间分析采 用多组均数的两两比较。交互作用采用两因素方差分析，P0．05表示有 显著性差异。 结果： l心脏成纤维细胞的鉴定：免疫细胞化学染色，光镜下见细胞呈梭形 或多角形，纤维连接蛋白染色呈阳性，胞浆内围绕胞核呈现棕黄色细密颗 粒，呈细丝状，PBS对照呈阴性，符合成纤维细胞的染色特征。免疫组化 抗波形蛋白、纤维连接蛋白染色阳性鉴定为所需的心肌成纤维细胞，纯度 达94％。 ． 2不同糖浓度对成纤