花背蟾蜍晶状体发育相关Pax6 variant新基因生物学特性及功能的初步研究.pdfVIP

中文摘要 Pax6是眼发育过程中最重要的调控基因之一。从果蝇到人类等大量物种的 眼发育和晶状体决定过程中都存在Pax6。Pax6可以形成多种蛋白亚型，如Pax6、 同亚型控制的。本课题通过建立花背蟾蜍晶状体不同发育时期的实验模型，以鳃 ofcDNAEnds)的方 血循环期的胚胎为材料，采用RACE(RapidAmpliphication 法，成功克隆得到花背蟾蜍Pax6 基因进行生物信息学分析，包括载体片段去除、基因开放可读框COpenReading Frame，ORF)预测、基因编码蛋白结构域预测、同源性的分析等。与花背蟾蜍 的改变可能导致反式激活功能的改变。配对盒基元序列和同源异型域这两个主要 功能区高度保守性意味着该基因在基础发育过程中的重要作用。 通过RT-PCR方法获得花背蟾蜍Pax6和Pax6variant差异部分基因序列， variant。经测序后正确的重组子 上构建了重组质粒pGEX-Pax6和pGEX．Pax6 variant 融合蛋白。经GST亲和柱层析进一步纯化获得了可溶性重组蛋白。以纯化的融 合蛋白GST-Pax6和GST-Pax6variant分别作为抗原，免疫家兔制备多克隆抗体。 利用酶联免疫吸附试验(EuSA)、WesternBlot检测其抗血清的效价、灵敏度和 特异性。结果表明，Pax6和Pax6 WesternBlot初步验证了转录因子Pax6从鳃血循环期到鳃盖完全封闭期都有表 达，而Pax6 variant仅在鳃血循环期表达，表明Pax6在花背蟾蜍晶状体发育过程 中起了更为重要的作用。Pax6 因短缺而失去反式激活功能。其DNA结合域与Pax6蛋白一样，可与Pax6蛋白 竞争，从而减弱甚至阻断Pax6蛋白执行功能。所以Pax6variant可能作为正常Pax6 蛋白的竞争抑制物，起显性抑制作用。 IV ^ ■ ABSTRACT Pax6isoneof factors the oftissues manytranscriptionduringdevelopmentincluding centralnervous and ofvertebratesand systemendocrine#ands also inanimals from to to regulateseyedevelopmentrangingjellyfishDrosophila humans．Thereareseveral isoformsofthe Pax6 Pax6， reported protein，including Pax6APDand studieshaveshownthatdifferentisoformsactivate Pax6(5a)．Previous differentsetsofdownstream targetsduringdevelopment． Wemadeuseofthe of raddeiStrauchat bloodcirculation tadpoleBufo 20(gJills