南方医科大学肝糖原提取2015级临床医学二第3实验室教程.docVIP

生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 级第二临床医学院 临床医学 组 别： 第7实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称 实验日期 实验地点 指导老师 评分 教师签名 批改日期 CuSO4 + 2NaOH = Na2SO4 + Cu(OH)2 2Cu(OH)2 + C6H12O6 = 2CuOH + 氧化型葡萄糖 + H2O 2CuOH = H20 + Cu2O (红色) Cu(OH)2 ==== H2O + CuO (黑色) 3、肝糖原定量 浓酸中，糖原水解成葡萄糖，浓硫酸使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物，即5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处呈现最大吸收峰。糖含量于10—100mg范围内时，溶液颜色的深浅正比于可溶性糖含量。利用此反应下的实验现象与同样处置后的已知糖含量的葡萄糖标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中稳定，故在显色之前，肝组织宜先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。 实验材料 仪器： 普通离心机，室温-100℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为 10mg级电子天平 剪刀、镊子、研钵 试管架，离心管，试管 刻度吸量管（2ml ,5ml），1000μl微量可调取液器 100ml容量瓶 白瓷反应板 试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/L NaCl溶液、浓HCl、 12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L） 蒽酮显色剂 实验步骤 肝糖原的提取 鸡肝约1.5g，剪碎 研磨至乳状 研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 取上清液 离心5min（4000r/min） 取沉淀 沸水浴2min，溶解沉淀 糖原溶液1ml 白瓷板中 沸水浴加热15min，冷却 加碘试剂0.1ml 加碘试剂0.1ml 蒸馏水 0.1ml 糖原溶液0.1ml 糖原水解液0.1ml（2d） 糖原水解液 呈色对比 混匀 沸水浴2min，观察变化 注意事项： 提取肝糖原时：向上清液中加入等量的95%乙醇后，必须混匀。因上清液为水溶液，密度比95%乙醇大，析出液分两层。又：上清液已多于4ml，加入等量乙醇后，总量近9ml，混匀操作较困难，宜用倾倒混匀，或以玻棒搅拌混匀。 糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有相关性。葡萄糖残基20个以下时使碘呈红色，20-30个之间碘呈紫色，60个以上时碘呈蓝色。淀粉中因分支链长，呈蓝色；肝糖原分枝葡萄糖残基在20个以下（常为8-12个），吸附碘后为红棕色。 糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。 肝糖原定量测定 鸡肝 0.15 g 沸水浴15min 冷却，全部转入100ml容量瓶中 加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液 取3支干净的试管，按下表操作： 试剂（毫升） 空白管 标准管 样品管 蒸馏水 1.0 —— —— 标准葡萄糖溶液 —— 1.0 —— 糖原提取液 —— —— 1.0 蒽酮溶液（0.2%） 2.5 2.5 2.5 混匀，沸水浴10min后冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（A）.计算： 肝糖原（g/100g肝组织）= × × × 1.11× 0.05 实验现象与结果讨论 鸡肝肝糖原成分的定性测定 步骤简述 实验现象 鸡肝约1.5g，剪碎 两次加入CCl3COOH研磨至乳状研磨成肝匀浆 肝脏碎片研磨之后呈灰黄色，两次加入试剂后均无明显变化 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 试剂分层：上层为透明无色液体，下层为灰黄色沉淀 取上清液加入95%乙醇 离心5min（4000r/min） 取沉淀 试剂分层，上层液体无色透明，下层为白色沉淀 沸水浴2min 沉淀溶解 鸡肝提取液在白瓷板中的对照显色反应 加入糖原与碘液的一侧呈棕红色反应，对照组仍为黄色 鸡肝提取液水解后加入班氏试剂再次水浴反应 加入班氏试剂溶液为蓝色，再次水浴后，溶液中产生砖红色沉淀 鸡肝肝糖原的定量测定 步骤简述 实验现象 鸡肝0.15