哮喘小鼠肺内CGRP免疫反应阳性神经纤维的变化论文.docVIP

　　哮喘小鼠肺内CGRP免疫反应阳性神经纤维的变化论文 .freela;calcitonin gene-related peptide;nerve fibers;immunohistochemistry;mouse Abstract:AIM To investigate the changes of distribution of the calcitonin gene related peptide（CGRP）in the lungs of asthmatic mice.METHODS The mice a group and control group.Immunohistochemistry and puter image analysis bers of CGRP-IR positive fibers in aira group.The positive fibers erging like a string of beads.freelooth muscle layer and basement membrane.In addition，nude CGRP-IR positive fibers ucosa.The numbers of positive fiber a group（P 0.01）.CONCLUSION There is close rela-tionship beta，ay be a reason for persistence and progress of asthma. 0 引言 近年来随着有关神经肽研究的不断深入，证实呼吸道广泛存在着神经肽网，神经肽与哮喘的发病关系日益受到国内外学者的关注.有研究表明，哮喘时患者肺泡灌洗液及血液CGRP含量明显高于对照组［1］ ，提示CGRP可能参与了哮喘的发病过程.然而对哮喘时CGRP增多的确切原因尚不清楚.已知CGRP在肺内尤其在粘膜及粘膜下主要分布于迷走神经传人纤维内，通过轴索反射释放或迷走反射能导致血管扩张、通透性增加、炎性细胞尤其是嗜酸性细胞在气道周围浸润.含CGRP纤维在肺内分布多寡或（和）其活性增高可能是造成气道高反应性的原因之一.我们应用免疫组织化学方法结合图像分析技术研究了哮喘时肺内CGRP免疫反应（CGRP-IR）阳性纤维的分布和形态改变，为探明哮喘的机制提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料 成年雄性BALB/c小鼠20只，体质量18～20g，本校实验动物中心提供.随机分为2组，即哮喘组和对照组. 1.2 方法 ①哮喘组按文献［2］复制小鼠哮喘动物模型，即实验的第0日腹腔内注射100g L-1 卵白蛋白0.2mL;第15日开始吸入10g L-1 卵白蛋白气溶胶30min，每日1次，连续14d.对照组用生理盐水代替卵白蛋白.②于实验第30日以戊巴比妥钠（40mg kg-1 ，ip）麻醉豚鼠，开胸经主动脉灌注10mL生理盐水，继以新配制的4℃40g L-1 多聚甲醛PB溶液（0.1mol L-1 ，pH7.4）50mL持续灌注10min，取出肺脏，4℃40g L-1 多聚甲醛后固定24h，入200g L-1 蔗糖PB溶液中，4℃过夜.③HE染色:恒冷箱切片，片厚8μm，贴片于10g L-1 明胶+50mg L-1 硫酸铬钾处理过的载玻片上，室温干燥30min后，常规HE染色.④免疫组织化学染色，片厚14μm，贴于载玻片上，室温干燥30min后，以0.01mol L-1 KPBS（pH7.4）浸洗，经800mL L-1 甲醇+30mL L-1 H2 O 2 封闭15min，入30mL L-1 Triton X-100中30min，KPBS浸洗3×10min，切片入兔抗CGRP血清（1∶4000，Onco-gene Science）室温孵育24h.KPBS浸洗3×10min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清（1∶500，Sigma），室温孵育3h，KPBS浸洗3×10min，入ABC复合物（1∶500，Sigma）室温孵育2h.葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺法显色.显色反应终止后，常规脱水透明，DPX封片.⑤图像分析:以肺内气道为分析对象，显微镜下图像分析，测量单位玻片面积内CGRP-IR阳性纤维条数. 统计学处理:按均数和标准差进行两组t检验. 2 结果 2.1 正常及哮喘小鼠肺组织HE染色 与正常组相比哮喘组可见气道平滑肌外层、粘膜下层和外层可见大量炎性细胞浸润（Fig1），粘膜杯状细胞增多（Fig2），大气道周围形成较多的淋巴样结节组织，可见大量嗜酸性细胞，支气管平滑肌增厚，管壁环行肌肥大. 2.2 正常小鼠呼吸道CGRP┐IR阳性纤维分布特点 从支气管至终末