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AA几种肿瘤常用检测方法 1．端粒酶活性检测 　　很多恶性肿瘤中都能检测到端粒酶活性,端粒酶可以作为诊断这些肿瘤的生物学标志。在某些肿瘤中,端粒酶表达会随着肿瘤的进展而上调,因此又可作为肿瘤恶性度评价的一个指标。 端粒酶常用检测方法 1) TRAP 法:端粒酶是由蛋白质和RNA 构成的逆转录酶,可以用自身的RNA 为模板合成端粒DNA 而避免端粒的缩短。人大部分体细胞都不表达端粒酶。由于“末端复制问题”的存在,端粒在每次细胞分裂后就会缩短一点,当端粒缩短到一定程度就无法维持染色体的稳定,细胞最终衰亡。恶性肿瘤中端粒酶却能被重新激活而使细胞获得永生化。自从Kim创立了端粒重复序列扩增法(telomeric repeat ampli-fication protocol ,TRAP) 检测端粒酶的活性以来,大约85 %的恶性肿瘤被检测出具有端粒酶活性。在目前的肿瘤标志物中,端粒酶是惟一能在大部分肿 瘤中都以高阳性率检测到的物质,因此端粒酶是一个很好的肿瘤诊断标志。 该方法非常敏感,只要有10 个阳性细胞存在就可以检测出其端粒酶活性 。但是除了恶性肿瘤外,端粒酶活性也在一些正常细胞中被检测到,特别是有增生能力干细胞和活化的淋巴细胞,另外如甲状腺腺瘤 和肠腺瘤 等一些良性肿瘤中也能检测出端粒酶活性,从而使TRAP 法得到的结果复杂起来,因此光用定性的方法有时很难确认恶性肿瘤。但不少研究发现正常组织和良性肿瘤中端粒酶的活性相 对较低,所以可以用定量的方法进一步鉴定。传统的TRAP 法无法对端粒酶活性做准确定量。现在有人把实时PCR 技术与传统的TRAP 法相结合发明了实时定量TRAP 法( realtime quantitative telomeric repeat amplification protocal ,RQ2TRAP) ,能够对端粒酶活性进行较精确的定量,为良恶性的鉴别 诊断提供了有效的手段 。但由于设备和试剂很昂贵,目前还难以普及。值得注意的是, TRAP 法易发生细胞的污染而造成假阳性,尤其是活化的淋巴细胞,因此有人建议每次检测样本的细胞数应超过1 000个细胞,理由是在少于1 000 个淋巴细胞的抽提物中测不到端粒酶活性。 2)　端粒酶mRNA 检测:人端粒酶活性与两个成分的表达有关,一个是人类端粒酶RNA ( human telomerase RNA , hTR) ,另一个是人类端粒酶催化亚基( human telomerasereverse t ranscriptase , hTERT) 。hTR 在没有端粒酶活性的细胞中也有低表达 , 所以用hTERTmRNA 来评估端粒酶活性更为常用。hTERTmRNA常用检测方法有两种: RT2PCR 法和原位杂交组织化学法。 3)hTERT 蛋白检测:hTERT 蛋白在细胞内含量很少, 但Hiyama等 用免疫组织化学法于存档的石蜡包埋标本中在细胞水平上成功检测到了hTERT 蛋白, 说明hTERT 的免疫组织化学法可以作为回顾性研究手段。在免疫组织化学法中,单个hTERT 阳性细胞中的标记物密度并不说明端粒酶活性的高低,肿瘤组织的端粒酶活性水平主要取决于端粒酶阳性细胞和阴性细胞的比率。 4)端粒酶与肿瘤早期诊断 用各种无创和微创的方法采集细胞和组织来早期诊断肿瘤已越来越普遍。虽然目前形态学诊断仍是肿瘤早期诊断的金标准,但当取到的肿瘤细胞数量很少或细胞形态特征不明显的情况下,形态学的诊断就会很困难。端粒酶活性的检测非常敏感,只要有少量阳性细胞就可检测出来,所以端粒酶能为肿瘤的早期诊断提供客观依据。以下是在不同的采样标本中端粒酶的检测情况。 (1)分泌物和排泄物:当分泌物和排泄物中含有脱落的癌细胞时,可以检测到阳性细胞的端粒酶活性。Myung 等 用TRAP 法检测12 例胰腺癌患者的胰液发现,11 例端粒酶为阳性。Iwao 等 做的32 例端粒酶阳性胰腺癌样本中有4 例是原位癌。由于胰液中常含有新鲜脱落的导管上皮,并且胰腺导管上皮细胞癌的端粒酶表达水平很高,故检测胰液的端粒酶活性或hTERT mRNA 是早期诊断胰腺癌的有效手段。其他的分泌物和排泄物如痰液、尿液等样本中,恶性肿瘤的端粒酶阳性率不如想象中的高。在Eissa 等的研究中,膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率明显高 于正常对照组, 但阳性率只有58. 5 %。在Arai等的实验中,把具有端粒酶活性的肿瘤细胞置于尿液中,1 小时后其端粒酶活性只有原来的20 % ,3小时后酶活性消失。因此低阳性率可能与蛋白酶、尿素和酸性物质等可使端粒酶活性丧失有关。Sen等 用TRAP 法检测肺癌患者痰液中端粒酶活性,其阳性率也不超过60 %。即便如此,端粒酶在肿瘤的辅助诊断上仍有一定意义。 (2)灌洗和刷式活检:在灌洗和