农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌遗传转化体系的建立.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, June 25; 26(6): 802−808 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2010 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 农杆菌介导的甜瓜蔓枯病菌遗传转化体系的建立 1 1 2 1 1 任海英 ，方丽 ，李岗 ，茹水江 ，王汉荣 1 浙江省农业科学院 植物保护与微生物研究所，杭州 310021 2 浙江省农业科学院 农产品质量标准研究所，杭州 310021 摘 要: 甜瓜蔓枯病是当前危害瓜类的主要病害，严重影响甜瓜的产量和品质，但是蔓枯病菌Didymella bryoniae 病原 学研究还非常落后，关于该菌功能基因的研究还未见报道。本研究以携带潮霉素 B 磷酸转移酶基因(hph) 的 pBIG2RHPH2 作为转化载体，根癌农杆菌 C58C1 作为转化介体，转化甜瓜蔓枯病菌的强致病菌株 DB11 。研究发现， 甜瓜蔓枯病菌的最优转化体系为：甜瓜蔓枯病菌的分生孢子悬浮液浓度为1×106 个孢子/mL ，农杆菌悬浮液OD600 为0.15 ， 共培养时间48 h ，诱导培养基中添加200 μg/mL 乙酰丁香酮，选择培养基添加100 μg/mL 潮霉素B 、200 μg/mL 头孢噻 肟钠、200 μg/mL 氨苄青霉素和200 μg/mL 四环素。1×105 个蔓枯病菌分生孢子可以产生45 个左右的转化子，随机挑取 3 个转化子进行PCR 和RT-PCR 检测发现，在不含潮霉素B 的PDA 培养基平板上转化子连续培养5 代后，hph 基因仍 能稳定存在和转录，Southern blotting 检测发现，T-DNA 都是单拷贝插入3 个转化子的染色体内。本研究建立的甜瓜蔓 枯病菌的转化体系将为该病菌的功能基因研究和寄主与病原菌的互作研究提供重要技术支撑。 关键词: 甜瓜蔓枯病菌，根癌农杆菌介导的转化，T-DNA 插入突变 Transformation of Didymella bryoniae mediated by Agrobacterium tumefaciens 1 1 2 1 1 Haiying Ren , Li Fang , Gang Li , Shuijiang Ru , and Hanrong Wang 1 Institute of Plant Protection and Microbe, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China 2 Institute of Quality Standards for Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China Abstract: Gummy stem blight, a plant disease caused by Didymella bryoniae, is one of the major diseases in melon. The disease can seriously reduce melon yield and quality. However, little information is available on the genetics and functional genomics of the fungal pathogen. In this study, we developed an Agrobacterium -medi