普通生物化学实验-培训课件.pptVIP

三、实验仪器 电泳仪 电泳槽 注射器 长针头 吸管 培养皿 四、实验试剂 三羟甲基氨基甲烷（简称Tris） 贮备液的配制：按下表配制A、B、C、D、E、F各贮备液，然后冷藏于4℃条件下，以防变质。 染色液：0.05%氨基黑10B溶于7%醋酸溶液，或者用灵敏度高5倍考马斯亮蓝R250溶液染色。 脱色液：7%醋酸溶液。 电极缓冲液（pH8.3甘氨酸-Tris缓冲液）：甘氨酸28.8g，Tris 0.6g加水定容至1000ml. 示踪剂：0.01%溴酚蓝溶液。 序号 A B C D E F 1mol/L盐酸 Tris TEMED ACr Bis (NH4)2S2O3 蔗糖 加水并稀释至 PH 48ml 36.6g 0.23ml 100ml 8.9 48ml 5.98g 0.46ml 100ml 6.7 28g 0.735g 100ml 10g 2.5g 100ml 40g 100ml 0.14g 100ml 五、实验步骤 1.制胶： 取一支长10cm左右的玻璃管，在一端套上乳胶帽。 1）7%聚丙烯酰胺凝胶（PH8.9，分离胶）： 将试剂按A:C:H2O:F=5ml：10ml：5ml：15ml比例混合于一烧杯中.用滴管将分离胶加入玻璃管至3/4高度，表面再加少量水覆盖，在烘箱中25~35℃下聚合，当有界面出现时，表明已经聚合，吸取分离胶表面的水分。 2）2.5%聚丙烯酰胺凝胶（pH6.7 ，浓缩胶）： 将试剂按B:D:E:F=2ml：4ml：2ml：8ml比例混合于烧杯中，迅速将其用滴管加到分离胶上面。 加入1厘米高左右，在小心地加入一层薄水。 然后胶管于烘箱中25℃~35 ℃下放置，待第二次出现界面，表示聚合完成，除去表面水分。 1、简述核酸分离纯化的一般原则。 2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？ 【思考题】 DNA的定量测定二苯胺法 一、实验目的 1、学习和掌握二苯胺法测定DNA含量的原理和方法。 2、复习和掌握标准曲线的制作方法 二、实验原理 DNA分子中的脱氧核糖基，在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。（λmax=595nm）。 DNA在20—200微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比，可用比色法测定。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 试管 移液管 7200分光光度计 恒温水浴锅 三、实验仪器 三、实验试剂 1、DNA标准液（200ug/ml）：称取10mgDNA钠盐溶于5mol/l氢氧化钠溶液并稀释至100ml。 2、二苯胺试剂： A液：称取纯二苯胺1.50g，溶于100ml冰乙酸，再加浓硫酸1.5ml。贮于棕色瓶中。 B液：称取1.6ml乙醛溶于100ml蒸馏水中，临用时配制 临用时，将20mlA液和0.1mlB液混合即可 1.标准曲线的绘制 取干燥的试管6支，编号，按下表加入试剂： 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，以吸光度对DNA浓度作标准曲线。 0 1 2 3 4 5 DNA标准液 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 二苯胺试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 五、试验步骤 2.样品测定 吸取DNA样液1ml，加入二苯胺溶液2.0ml, 加毕，混匀，在60度水浴中保温45分钟，冷却后，在595nm波长下测吸光度，根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量。 注意事项： 1. 此方法测定DNA 含量灵敏度不高,若是DNA含量低于50ug/ml, 则难以测定。 2. 样品中少量的RNA并不影响测定, 但是蛋白质, 多糖及其衍生物, 芳香醛, 羟基醛等能与二苯胺反应成有机物,干扰DNA的定量。 1、DNA制品可用哪几种方法测定其含量，试从原理、准确性等方面加以比较。 2、实验中加入乙醛的作用是什么，请详细说明？ 【思考题】 维生素C的定量测定 （2，6-二氯酚靛酚滴定法） 维生素C的作用 1.参与氨基酸代谢 2.降低毛细血管通透性 3.刺激凝血功能 4.增加抵抗感染 5.参与解毒 6.抗组胺 7.阻止致癌物质生成 8.补充营养 9.治疗坏血病 10.治疗牙龈肿胀，牙龈出血 11.治疗各种急慢性传染病 12.辅助治疗过敏性疾病 13.参与神经递质，胶原当白和组织细胞间隙的合成 14.病后恢复期，创伤愈合期的辅助治疗 注意！