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单克隆抗体技术及其应用 报告人：杨金先 单克隆抗体技术简介 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 单克隆抗体（monoclonal antibody）：针对预定抗原的同一抗原决定簇的，高度同质的，且能保证无限量供应的抗体。 单克隆抗体技术的理论依据：抗体的多样性、克隆选择学说、抗体基因的重排理论、抗体结构与生物合成机制。 单克隆抗体制备过程的注意事项 严格进行无菌操作，防止污染（细菌、霉菌、支原体、细胞） 根据实验的目标及时进行细胞的检测与筛选，（ELISA、IFA、凝集、中和，……） 对筛选得到的阳性细胞克隆进行早期单克隆（有限稀释法） 在单克隆细胞建株过程中不定期验证检测 防止单克隆细胞过度生长 ——老化 死亡 单克隆抗体与免疫血清的比较 单抗 单克隆抗体技术的应用 我们实验室已经制备的单克隆抗体 鱼类Ig单抗 欧洲鳗血清IgM 欧洲鳗粘膜Ig 石斑鱼IgM 大黄鱼IgM 鳜鱼IgM 鮰鱼IgM Fish Disease Research Center Fish Disease Research Center 骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）： 单克隆技术的原理 丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT－） 无法在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 既不合成轻链又不合成重链 小鼠脾细胞 （B-Cell ）： 合成和分泌特异性抗体 无法进行体外长期培养 脾细胞－SP2/O融合细胞： HGPRT＋，能在HAT选择培养剂中生长 能无限地快速增殖 合成和分泌特异性抗体 HAT 单克隆抗体制备过程（示意图） 克隆形成 单克隆细胞→扩大培养，制备抗体、液氮冻存 SP2/O B细胞 细胞融合 有限稀释法进行单克隆 细胞融合的方法： 1、仙台病毒 2、PEG/DMSO 3、电融合 Monoclonal antibody 由杂交瘤细胞系产生的，针对同一抗原决定簇的抗体——高度均质。 由同一个B细胞克隆产生的同异质的抗体组成，是针对抗原的单一决定簇抗体。 单抗纯度高，专一性强、重复性好。无披次差异。 易于标准化。 能保证无限量供应。 免疫血清 又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。 由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成，是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。 通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分——特异性差。 不同批次的抗体制剂质量差异很大。 难以工业化批量制备。 2、治疗试剂 病毒等微生物的中和抗体 抗毒素—蛇毒、破伤风毒素，等 被动免疫治疗制剂 “生物导弹” ??? ??? 3、分子生物学研究工具 蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学——组织定位； 分子病毒学——结构分析； 特定生物分子的功能研究； 1、免疫学快速诊断试剂（抗体） 细菌 病毒 肿瘤因子 特定蛋白 农残检测 ??? ??? 诊断技术方法： ELISA（间接法、夹心法、竞争法） 免疫荧光法 胶体金 放射免疫法 ??? ??? 病原微生物 嗜水气单胞菌 杀鲑气单胞菌 鸡IBDV中和单抗 猪PRRSV 猪旋毛虫囊蚴 小瓜虫 其他单抗 人神经胶质瘤信号肽GBM1和GBM2 正在制备的单抗 鱼类虹彩病毒 鲤鱼SVC 刺激隐核虫单抗