pBM20快速克隆试剂盒.PDFVIP

pBM20 快速克隆试剂盒 地 址：北京市石景山区景山财富中心329 电 话：01052609503 网 址： 销售部：biomed2005@163.com 技术部：biomedsupport@126.com (pBM20 quick cloning kit) 测序部：biomed2005@ 合成部：oligo@ 使 用 说 明 书 试剂盒组成 组分 CL107-01(20次) CL107-02 (20次×3) pBM20Vector (20ng/l ) 20l 20l×3 Topoisomerase I 20l 20l×3 Control Insert 5l 5l 5×Reaction Buffer 200l 200l×3 M13F(-47) 引物干粉管 0.1OD 0.1OD×3 M13R(-48) 引物干粉管 0.1OD 0.1OD×3 保存条件：-20 ℃保存一年 产品介绍 pBM20快速克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。不仅 适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq 等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。试剂盒中的pBM20 载体为线性化的质粒。可以用引物对M13F(-47)和M13R(-48) 进行菌落PCR鉴定阳性克隆。 产品特点 ⑴连接反应仅需5-30 分钟。 ⑵适用于平末端PCR产物和带A尾的PCR产物。 ⑶pBM20载体具有氨苄青霉素和卡那霉素双抗性基因。 ⑷载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。 注意事项 ⑴片段的选择：各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。 ⑵引物要求：PCR引物5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。 ⑶连接条件： ① 片段大小为0.1-1 kb(含1kb):5-10分钟 ② 片段大小为 1-2 kb(含2 kb):10-15分钟 ③ 片段大小为 2-3 kb(含3 kb):15-20分钟 ④ 片段大小大于3 kb:30分钟 如片段为切胶回收产物，反应时间取最大值，如1.5kb的片段连接时间为15分钟。 ⑷连接温度：室温 (22℃-37℃)。可使用PCR仪控温，最佳反应温度：25℃。若片段有高GC等复杂结构，可在37℃反应。 ⑸常规连接反应体积为5l，如回收片段过稀，可扩大到10l。 ⑹产物要求：为保证PCR产物完整，强烈建议设置72℃后延伸5-10分钟。连接前使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的质量 和纯度，如PCR产物为非单一性条带，目的片段一定要切胶回收。如PCR产物为单一条带，无引物二聚体，可以取1-3l的 PCR产物直接连接。应该注意模板的抗性。如果模板质粒为氨苄抗性，那么转化后的细菌应涂布在卡那抗性的LB平板上。 模板质粒为卡那抗性应涂布在氨苄抗性的LB平板上。 ⑺片段用量：胶回收的DNA片段一般使用量为50ng左右。对照片段为5’端带CACC四个碱基的全长EGFP基因的平末端产物。 ⑻往M13F(-47)和M13R(-48) 引物干粉管加90l灭菌水即为5M浓度的引物。 操作步骤 1. 连接反应 按下表，在一个0.2ml PCR管中依次加入 组分 体积 （注意：如PCR产物直接连接，则无需添加 Reaction Buffer） 5