实验六 青贮料的细菌学检查.docVIP

实验六 青贮料的细菌学检查 一、实验前的几点儿说明 点名,查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。 二、板书部分： （一）目的要求 1.掌握青贮料中乳酸菌和腐败菌的计数方法。 2.认识青贮料中乳酸菌的形态。 （二）实验内容 1.青贮料中乳酸菌的计数（示教）。 2.青贮料中腐败菌的计数（示教）。 3.用青贮汁液涂一张抹片并进行革兰氏染色，并在油镜下观察。 （三）作业 1.试述青贮料中乳酸菌的计数方法。 2.绘制乳酸菌的形态图。 三、实验内容 （一）青贮料样品的取样及稀释液的准备 1.青贮料样品中的采取 测定青贮料中乳酸菌和腐败菌数目时，首先是在青贮窖（塔）的不同层次中，以无菌操作方式采取有代表性样品20g以上备用。 2.称取青贮料样品 将上述样品混合均匀，弃去大部分，留下20g左右，用无菌剪刀剪碎，分别在两个平皿中各称取一份，每份5g，一份置烘干箱中测定水分，另一份留下作稀释用。 3.稀释液的制备 将留下的5g青贮料样品，置于盛有50ml无菌生理盐水的三角瓶中（1：10），摇振一刻钟，取1ml加入盛有9ml无菌生理盐水的试管中，成1：100即10-2稀释，如此重复再稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。 （二）乳酸菌的计数 从10-4、10-5、10-6稀释液中，用无菌吸管吸取1ml，分别放在三个无菌平皿中，每个稀释度重复三次，共作九个平皿。吸取稀释液时，要先从稀释度最大的开始，依次再取稀释度较小的稀释度，这样可节省无菌吸管。 将融化并冷却至45~50℃（用手摸不烫时）的白菜浸汁琼脂培养基，倾注适量（约12-15ml）到各个不同稀释度较小的平皿内，立即在桌上轻轻与稀释液混匀，待凝固后，倒置，分别标明相应稀释度、时间、组别等、置30℃左右恒温箱内，培养数日后，即可形成菌落。 因乳酸菌产生乳酸，能使附近碳酸钙溶解，菌落周围呈一透明圈。但不是所有的这种菌落都是乳酸菌，因此计数所得数字为大约的乳酸菌数。典型的乳酸菌与大肠杆菌可以根据透明圈大小辨别。一般乳酸菌的透明圈与大肠杆菌透明圈比较均较大。若要较精确地计算其中乳酸菌数，则须进一步鉴定。本实验中凡有透明圈者均算作乳酸菌菌落。选最清晰地形成单独透明圈菌落的三个平皿，计算菌落总数，再求三平皿的平均菌落数，最后算出每克青贮料中乳酸菌数。对各种不同青贮料和不同贮存时间所含乳酸菌数可以进行比较。 （三）腐败菌的计数 操作方法同乳酸菌的计数法，但所用培养基为营养琼脂中加入0.4%明胶，制成明胶琼脂培养基，代替白菜浸汁琼脂培养基作倾注培养。置37℃或38℃温箱中培养，待细菌生长后，倾明胶液化试剂于平板上面，其用量以恰好能盖满平板为度。若明胶液化，则菌落周围呈透明圈，证明此菌能产生蛋白酶（明胶酶Gelatinase）,没有明胶酶的地方则呈现乳白色。由透明区大小，可看出细菌液化明胶的强弱。若要精确测定厌氧和好氧的腐败菌，则应在明胶琼脂平板上，均匀涂布定量青贮料样品稀释液，进行厌氧或好氧培养后，再倾入明胶液化试剂，观察菌落透明圈的有无。 此试验的原理为试剂中含有升汞及浓盐酸，二者皆可使蛋白质发生白色沉淀（明胶为一种动物性蛋白质）。若细菌能将其附近的明胶分解，则加入试剂后不现白色沉淀。 算出每克干青贮料中腐败菌数的方法和乳酸菌的计数相同。 （四）青贮料中乳酸菌形态的认识 用青贮料汁液和挑选几个乳酸菌菌落抹片，用革兰氏染色，在油浸镜下观察其个体形态和排列方式。 明胶液化试剂： 升汞 15g 蒸馏水 100ml 浓盐酸 20ml 先将升汞溶于水中，然后再将浓盐酸加入混合即成。 白菜浸汁琼脂培养基 新鲜甘蓝或白菜 100g 琼脂 4g 葡萄糖或蔗糖 4g 自来水 约150ml 碳酸钙 20g 四、示教部分 1.青贮料样品中的采取 测定青贮料中乳酸菌和腐败菌数目时，首先是在青贮窖（塔）的不同层次中，以无菌操作方式采取有代表性样品20g以上备用。 2.称取青贮料样品 将上述样品混合均匀，弃去大部分，留下20g左右，用无菌剪刀剪碎，分别在两个平皿中各称取一份，每份5g，一份置烘干箱中测定水分，另一份留下作稀释用。 3.稀释液的制备 将留下的5g青贮料样品，置于盛有50ml无菌生理盐水的三角瓶中（1：10），摇振一刻钟，取1ml加入盛有9ml无菌生理盐水的试管中，成1：100即10-2稀释，如此重复再稀释成10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。 4.乳酸菌的计数 从10-4、10-5、10-6稀释液中，用无菌吸管吸取1ml，分别放在三个无菌平皿中，每个稀释度重复三次，共作九个平皿。吸取稀释液时，