AOEB染料精确称取AO(吖啶橙)、EB各1mg,分别溶于10ml.docVIP

AO/EB染料: 精确称取AO(吖啶橙)、EB各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS中使之配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，备用。AO/EB染色及观察结果：取已经培养好并加样孵育后的预观察细胞悬液 100μl，加入AO/EB染料4μl混匀，置1滴于载玻片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞统计结果。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。凋亡比例=(VA+NVA)/(VN+VA+NVA+NVN)*100% 正常细胞(核染色质结构正常，胞膜完整，着均匀的绿色);早期凋亡细胞(核染亮绿色呈致密斑块或碎片状);晚期凋亡细胞(核染橘红色呈致密斑块或碎片状);坏死细胞(胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色) 取AO(100 μg/ml)和EB(100 μg/ml)等体积混匀制成AO-EB荧光染液。将培养细胞用PBS离心洗涤两次,稀释至106/ml,取1　ml细胞悬液(106细胞)离心收集细胞,加入25 μl PBS重新悬浮细胞,与1 μl AO-EB荧光染液混合,取10 μl点片,荧光显微镜下观察、照像。 AO/EB染色液怎么配？ 吖啶橙和溴乙锭分别溶于PBS(PH7.2)，浓度为100μg/mL。 临用前，按1∶1混合即可。 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（细胞爬片），在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存。）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。（如制成细胞悬液，取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。）（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。） 吖啶橙能透过细胞膜而嵌入DNA，使之呈现绿色。溴化乙锭仅能透过破损的细胞膜而嵌入DNA使之呈橘红色，且橘红色亮度胜过吖啶橙的绿色。凋亡的细胞由于染色质高度浓缩使其细胞核着色不均匀，而未凋亡的细胞则呈正常结构，着色均匀一致，在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞，核染色质显现绿色并呈固缩状或片段状；非凋亡的死亡细胞, 核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞，核染色质着橘红色并呈固缩状或片段状。 AO／EB染色最好是活细胞染色，因为该实验的原理就是AO可以被活细胞吸收。而EB不能透过或细胞完整的细胞膜。这样，对于活细胞而言AO和EB进入细胞的速度是不一样的，所以显出AO的绿色，对于死细胞，AO/EB是同时进入细胞的，但是EB的橙红色比AO的绿色耀眼，所以，显出的是EB的橙红色。凋亡细胞介于二者之间。如果是死细胞（固定过的）细胞膜就不是完整的了。这样凋亡和死亡的假阳性率必然要增加。 用AO/EB染色的荧光显微镜的激发和阻断波长要多少? 488激发，接收为500-550，图片很好的 1.1　细胞系及主要试剂　　U251人脑胶质瘤细胞系引自第二军医大学长征医院神经外科。吖啶橙(Acridine orange,AO)、溴乙锭(Ethidium bromide,EB)、噻唑蓝(Thiazolyl blue,MTT)、碘化丙锭(Propidium iodide,PI)均为Sigma公司生产，DMEM(Gibco公司生产)，顺铂(DDP，山东齐鲁制药厂生产)。　　1.2　实验处理及方法　　1.2.1　细胞培养：U251细胞由含10％小牛血清的DMEM培养基37℃5％CO2恒温孵箱培养。试验前用台盼蓝染色法鉴定活力在98％以上。　　1.2.2　凋亡的诱导及AO/EB双染色〔1〕：待细胞长至80％汇合，加入顺铂(5、10、20μg/