分子生物学实验概念.doc

实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 目的 掌握质粒的提取方法琼脂糖凝胶电泳pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）: 按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。 6×上样缓冲液: 0.25% 溴酚蓝 40%（W/V）蔗糖水溶液 1% 琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖溶于100ml 1×TAE电泳缓冲液中，溶化后加入5μl 10mg/ml EB贮存液，使凝胶中EB终浓度达到0.5mg/ml。 (4) 细菌培养基 含抗生素的LB培养液酵母提取物 5g 蛋白胨 10g NaCl g 琼脂 15～20g 水 1000mLpH 7.4～7.6 将上述培养基 以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌。应放入冰箱内暂存。 含抗生素的LB琼脂平板LB培养基中加15 g琼脂，以1.05kg/cm2（15磅/英寸2），121.3℃，20分钟高压蒸汽灭菌 （5） Promega EastepTM质粒小提试剂盒μL、10μL加样器及其枪头、盒子；灭菌的1.5mL eppendorf管；试管及试管塞：小型离心机； 无水乙醇。 四、实验步骤 （一） 大肠杆菌的制备从新鲜LB琼脂平板（含抗生素）上挑出单个菌落接种于ml LB培养液中（含相同的抗生素），于37°C摇床培养（12-16小时）。 大肠杆菌的裂解 1.将1-5ml (高拷贝数的质粒)或10ml（低拷贝数的质粒）的细菌培养物于 10,000×g 离心5分钟。弃去上清液并吸去剩余培养液。 2.加入250μl细胞悬浮液，震荡或吹打以充分混匀细胞。充分混匀细胞非常关键。如果悬浮的细胞不在离心管中，则将其转移至1.5ml无菌离心管中。 注意：以下操作步骤不要震荡以避免切断染色体DNA。 3.加入250μl细胞裂解液，颠倒离心管4次以充分混匀（不要震荡）。室温孵育细胞悬浮液至澄清，孵育时间大约需要1-5分钟。 注意：在加入碱性蛋白酶溶液（第4步）之前观察裂解液是否变为澄清非常重要。但孵育时间不要超过5分钟。 4.加入10μl 碱性蛋白酶溶液并颠倒离心管4次以充分混匀。于室温孵育5分钟。碱性蛋白酶能够灭活核酸酶及其它在细菌裂解过程中释放出的能够影响分离质粒质量的蛋白。碱性蛋白酶孵育时间不要超过5分钟，否则质粒DNA会出现缺口。 5.加入350μl 中和溶液并迅速颠倒离心管4 次以充分混匀（不要震荡）。 6.于室温将细胞裂解液以最大速度（约14,000×g）离心10 分钟。取澄清裂解液进行以下步骤的质粒DNA的分离及纯化。 7．准备好微量纯化柱和收集管。一个样品需要一个微量纯化柱和一个收集管，将微量纯化柱插入收集管中。 用移液枪将澄清裂解液（大约850μl）转移到准备好的微量纯化柱中，避免碰到沉淀物。 注意：如果转移过程中不小心带入了白色沉淀物，需将微量纯化柱中的内含物重新转移到一个无菌1.5ml离心管中并以最大速度离心5-10分钟。再将离心后的上清液转移至先前使用的微量纯化柱中。微量纯化柱可以重复使用，但仅限于同一样品。 于室温，14000×g离心1分钟，将微量纯化柱从收集管上移开，弃去收集管中的液体后重新装回到收集管上。 加入750μl柱清洗液（已加95%乙醇）。 于室温，14000×g离心1分钟，清空收集管。 加入250μl柱清洗液重复清洗步聚（已加95%乙醇）。 于室温，14000×g离心