传统生化制药存在的问题.ppt

Contents of chapter 3 2、菌体生长速率对质粒拷贝数和质粒稳定性的影响：高生长速率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。 三、质粒稳定性的分析方法 样品 （2）细胞破碎技术 工程菌高效表达的产物大部分在胞浆内； 细胞壁以肽聚糖为骨架，由乙酰葡萄胺和乙酰胞壁酸交替排列，形成有一定韧性的网状结构。 机械破碎方法 超声波法 在15—25千赫(kHz)的频率下操作； 操作时易引起温度上升，需要对细胞悬液做冷却处理； 大规模操作，因需要输入很高能量，提供必要的冷却而难于实用； 适用于破碎少量细胞，尤其是破碎包涵体表达的细胞。 高压匀浆法： 细胞悬液在高压匀浆器中受瞬间失压和高速流动形成的剪切、碰撞的作用，使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 高速珠磨法： 细胞悬液和助磨剂在高速珠磨机中被快速搅拌研磨，经剪切、碰撞，促使细胞壁破裂； 大规模破碎细胞的常用方法。 非机械破碎方法 酶解法：常用溶菌酶等破坏细胞壁 酶价格昂贵 、纯化过程中需除尽； 不适于大规模生产。 渗透压冲击法 适于细胞壁较脆弱或用酶预处理的菌体； 适用于分离周质空间分泌表达的基因工程产物。 反复冻融法 破碎率低； 引起对冻融敏感的蛋白质变性。 化学裂解法 用有机溶剂（苯、甲苯）和表面活性剂(SDS等)、抗生素、变性剂等改变细胞壁或细胞膜的通透性； 应防止目的产物变性。 选择合适的破碎方法，需要考虑 1、细胞数量； 2、产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； 3、需要破碎程度和破碎速度； 4、尽可能采用温和的方法。 细胞破碎方法 （3）固液分离技术 离心分离 膜分离 双水相萃取 常用的双水相系统为PEG/无机盐和PEG／葡聚糖两种。 上相（PEG富集相）含有目的蛋白(也可能含较多杂蛋白)，下相含细胞碎片、核酸、多糖等。 发酵液 细胞分离 细胞破碎 固液分离 细胞碎片分离 包含体 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 胞外产物 发酵液的预处理：发酵结束，对发酵液进行适当加热、调整pH、加入絮凝剂等预处理，以改变发酵液的性质，便于以后的提取。 初级分离阶段：在细胞培养结束之后，其任务是分离培养液、破碎细胞释放产物（如果产物在胞内）、溶解包涵体、复原蛋白质、浓缩产物和去除大部分杂质等。 纯化精制阶段：在初级分离的基础上，用各种高选择的手段和方法，将目标产物和干扰杂质尽可能地分开，使产物的纯度达到相关的要求。 四、分离纯化的技术 1、细胞破碎与固液分离 （1）细胞分离： 细胞分离常用的是离心分离的方法 膜过滤法液逐步得到应用（微滤） 适用性有限，只适合于对碱或酶稳定的产物 方法简单，可大规模应用 经碱或酶的处理使细胞壁或膜破坏，使产物释放出来 碱或酶处理法 6 适用性有限，只适合于对有机溶剂或表面活性剂稳定的产物 方法简单，细胞内含物释放少，产物较纯，可大规模应用 利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁或膜的通透性，使胞内产物得以释放 有机溶剂或表面活性剂法 5 操作比较复杂，条件要求严格，只适用于少量榈的处理，费用高 适用于位于胞内质的产物释放，细胞的破碎率低，但产物的释放较好，纯度较高 利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎 渗透压法 4 超声波处理会产热，需要冷却，破碎率较低，需反复进行破碎，应用面较窄 操作简便，可连续或批式操作 超声破碎机 利用超声波形成空穴产生压力冲击使进行破碎 超声波破碎法 3 珠磨时会放热，需要高效冷却，不同细胞的破碎条件差异大 操作简便、稳定，可连续批式操作，破碎率可以控制，容易放大，适用于工业放大 细胞珠磨破碎机 利用固体的剪切进行破碎 珠磨破碎法 2 加压放热，需要冷却，否则生物活性物质会失活；破碎率较低，压力不稳定，需要进行反复破碎 操作简便，可连续操作，适用于不同的细胞 压力破碎机 利用压力释放时的液固剪切进行破碎 压力破碎法 1 缺 点 特 点 设备 原 理 方 法 序号 人胰岛素原表达法 生产技术的评价 在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。 虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。目前采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。 3. 分泌型重组人胰岛素表达法 上述三种重组路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体形式存在于胞质中。 将胰岛素或胰岛素原编码序列与β-内酰胺酶基因拼接，