第四章微生物细胞破碎.ppt

第四章 微生物细胞破碎 本章主要内容： 一、细胞壁的组成与结构 二、细胞破碎的方法 三、细胞破碎率的测定 四、破碎技术的研究方向 动物细胞：大多无细胞壁，其培养产物大多分泌在培养液中 植物细胞：多为胞内产物。 微生物细胞：大多数小分子代谢产物分泌在胞外；大多数大分子产物和基因重组产物为胞内产物，如胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等均为胞内产物。 对于胞内产物，首先必须将细胞破碎，使产物得以释，才能进一步提取。 细胞破碎：就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。 一、细胞壁的结构和特点 微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁（外壁）：具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤的功能； 细胞膜（内壁）：具有高度选择性的半透膜，控制胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。 1 细菌细胞壁结构 革兰氏阳性菌： 革兰氏阴性菌： 典型的微生物： 大肠杆菌 （胰岛素、人生长激素、α-干扰素） 2 酵母细胞壁的结构示意图 3.真菌的细胞壁 真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。 真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 4. 细胞壁的结构与细胞破碎的关系 （1）在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。细胞个体小、呈球形、壁厚、聚合交联程度高则难破碎。 （2）在使用酶法和化学法溶解细胞时，细胞壁的组成最重要，其次是细胞壁的结构。 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。 二、细胞破碎的方法 2、常用细胞破碎方法 （1）珠磨法 ①工作原理： 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。 ● 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、 Braun匀浆器； ● 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； ● 在工业规模中，可采用高速珠磨机。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。 ②影响细胞破碎的因素 a.珠体的大小 实验室规模珠径0.2mm， 工业规模珠径大于0.4mm b.珠体的装量 80～90％ c.搅拌速度 适当 d.操作温度 5～40℃ e.被处理细胞的特性 （2） 高压匀浆法 ①工作原理： 细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀之间的环隙高速喷出，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。 高压匀浆阀结构示意图 高压匀浆法适用的范围 高压匀浆法适用的范围： 酵母和大多数细菌细胞的破碎； 料液细胞浓度可以很高，20%左右。 不宜使用高压匀浆法： 易造成堵塞的团状或丝状真菌， 较小的革兰氏阳性菌， 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀） 三、细胞破碎率的测定 1.直接测定法 方法：样本适当稀释后，通过平板计数技术或在血球计数板上用显微镜观察来实现染色细胞的技术。 平板计数法计数时间长；只有活细胞才被计数，误差大；细胞聚集时，不利计数。 显微镜计数相对快速简单，采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。 被破碎的细胞的数量占原始细胞数量的百分数，即 其中N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。 2. 目标产物测定法 3. 测定导电率 选择破碎方法时，需要考虑下列因素： 选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 四、工艺实例 1、干扰