精液冷冻概述_培训课件.pptVIP

四川大学华西第二医院人类精子库 精液冷冻技术概述 四川大学华西第二医院人类精子库 * 精液冷冻历史回顾 1776年Spallanzani偶然发现将人精液埋藏于冰雪仍可存活 1886年Mantegazza发现在－15℃下的精子可以存活较长时间； ???? 1937年Jannel报告人类精子可在-196℃中存活； ???? 1949年Polge首先发现甘油对冷冻精子具有特殊保护作用。 * 冷冻精液的临床意义 供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期进行； 对有先天遗传疾病和严重传染性疾病的患者可以使用； 进行生殖保险；如男性绝育手术者，肿瘤患者化疗前，从事危险行业者等； 对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩； 对于取精困难和梗阻性无精症的患者在ICSI治疗时，用冻融精子代替新鲜精子可避免反复抽吸睾丸或附睾，利于医患双方掌握治疗进度。 * 冷冻损伤原理 冰晶损伤学说 ice crystal damage 溶液效应学说 solute damage * 冷冻原理 降温过程分期： 温度休克期RT~5℃ 潜热扩散期5～0℃ 冰晶形成期0～－15℃ 再结晶期－15～－79℃ 保存期－80～－196℃ * 冷冻损伤原理 精子 示意图： 精子细胞外 冰晶形成 胞内冰晶形成 细胞脱水 冰晶损伤 溶液损伤 降温 快速 慢速 * 冷冻对精子产生的损伤 超微结构的损伤： 冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状改变或破损，胞浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿胀是形态改变得主要征象。 精子功能： 日本学者研究根据精子顶体功能和穿透率无显著变化，发现冷冻精子授精能力无下降。 染色体： 目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍存在争论 * 冷冻保护原理 冷冻保护液 渗透性 增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的冰点，减少冰晶的形成。 非渗透性 调节PH，细胞外渗透压，增加营养 不同温区最适的冷冻速率 研究表明过快或过慢的降温都是不合适的，应根据不同的冷冻保护剂选择各个温区最佳的降温速度。目前还未找到。 * 冷冻保护剂 （CPM） 根据CPM的特性： 非渗透性CPM：卵黄、葡萄糖、蔗糖 渗透性CPM：甘油 根据CPM种类 : 单一甘油型 复合甘油型 无甘油型 * 冷冻保护剂 （CPM） 各成分的主要作用 : 甘油：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，降低细胞内液冰点，减少冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身对细胞也有一定的毒性，一般终浓度控制在7～10％。 卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，防止顶体外膜破裂。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并且有病毒感染和过敏反应当可能。 * 冷冻保护剂 （CPM） 各成分的主要作用 : 葡萄糖：与调节渗透压有关 缓冲系统：可以结合游离的H+和OH－，有助于溶液和精子脱水 现在常用CPM: 单一甘油型 G－Y－C型（甘油－卵黄－柠檬酸钠型） TEST－G－Y－C（TES－Tris缓冲系统＋GYC）型 G－Y－C－G型（GYC＋谷氨酰胺） 改良T－G型（改良Tyrode液－甘油型） * 冷冻保护剂 （CPM） 改良T－G型，它的优点 有： 相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均62.6％） 可准确配制 不含卵黄，消除可能的病毒感染和过敏反应 背景清晰，无大量颗粒和碎片 储存时间长，可达3个月 * 降温程序 分类： 程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。 ? 手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。 注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！ 降温前处理： 在室温中将精液与CPM 1:1混匀，通常是在20min逐量加入，且用振荡器持续振荡，转速约300/min。此过程在提高精液复苏率中起重要作用之一。 * 降温程序 程序降温 得到多数学者的认同，有精确定降温速率控制，复苏率较高。缺点是仪器昂贵，使用和维护费用也较高，不适合普及。 * 降温程序 手工降温： 25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—LV（LN上5cm处）-10min—LN 25℃（RT下加CPM）—4℃-60min—－20℃-20min—LN 25℃（RT下加CPM）—4℃-20min—－20℃