8 9烟草悬浮细胞的培养与保持.pptVIP

实验9-10 烟草悬浮细胞的培养与保持 ;目的要求: 了解植物细胞悬浮培养和平板培养的基本原理，掌握植物细胞悬浮培养和平板培养的方法和技术，掌握无菌操作技术。;1. 材料：烟草悬浮培养细胞。 2. 试剂、培养基：实验8中配制好的培养基；75％酒精。 3. 器具：无菌培养皿、移液器、无菌移液器嘴、酒精灯、脱脂棉球、烧杯、标签纸、记号笔、超净工作台、恒温培养箱、恒温空气摇床、光照培养箱。 ;1．接种前，用75％酒精擦拭超净工作台，将培养基和接种用的器具放入超净工作台；打开超净工作台紫外灯，照射20－30分钟后开送风开关，10分钟后可进行无菌操作。 2. 用75％酒精对移液器和手进行表面消毒。 3. 在酒精灯上对装有培养基或培养物的三角瓶或培养皿进行开封，用无菌的移液器取悬浮培养的烟草细胞至不同的新鲜培养基中：10ml悬浮细胞至50ml新鲜液体培养基中；用移液器取1ml悬浮细胞至固体培养基上，倾斜平板，用移液器移去多余的液体。将对三角瓶或培养皿进行封口、标记。 4. 培养： 把培养瓶放到恒温摇床上进行震荡培养。调整摇床的旋转速度，使之为120rpm。培养温度为28℃，在黑暗中培养。 把固体平板放入光照培养箱中， 28℃，黑暗恒温培养。 5. 一周后观察、记录并继代培养：（取悬浮细胞，用FDA染色，观察细胞的死、活），记录细胞生长、死亡情况；污染情况；愈伤组织的生长状态。并对悬浮培养细胞再进行继代培养，以用做进一步的实验材料。;针对观察结果，对实验操作步骤和要领进行分析，总结影响实验结果的主要原因。 ;结果观察： （1）细胞生长、死亡情况 （2）污染情况 （3）愈伤组织的生长状态 （4）中性红染色观察液泡 或：改良苯酚品红观察细胞核完整性（凋亡情况检测） 或：质壁分离情况及膜皱缩情况观察