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四．不包埋法（冰冻超薄切片法） 兼具包埋前法及包埋后法的优点 敏感，细胞超微结构保存好，可1d内完成 步骤： 1.小块组织1～4％多聚甲醛固定（增加组织硬度）。 2.浸泡于2.3mol/L蔗糖溶液，平衡渗透压。 3.包埋于10％明胶，液氮速冻，超薄切片（50～60nm）。 4.置镍网免疫细胞化学染色。 五．双标记或多标记 选包埋后法，金标记（不同抗原标以不同直径之胶金颗粒）， 如用间接法，标以不同直径胶金颗粒之二抗如来自同一种类动物时， 防止叠加污染之方法有： 1．双面分别标记，谨慎操作 2．分步固定（灭活） 第一重特异一抗 过量金标记二抗 多聚甲醛固定 （饱和第一重一抗之Fc） （灭活二抗中未被中和之Fab） 第二重特异一抗 第二重金标记二抗 IEM技术除广泛应用于透射电镜外亦可 应用于扫描及冷冻蚀刻电镜技术（略）。 X45,000→ ←X7,500 IFNg-R IgG Κ ，λ 这种双固定法有何优势？ * * 丙酮与包埋剂相互混合的作用？ * 电子束轰击会产生什么后果？ * * 这一滴液体是不是就是染液？ * * M是系膜细胞吗？E是内皮细胞吗？ * 外围是什么蛋白质？ * 这是什么？ * * 这是什么？ * * * 0.2mm 0.2μm 0.2nm 像差、衍射效应 像差 免疫电子显微镜技术 免疫电镜（Immunoelectron microscopy,IEM） 高电子致密物标记抗体 免疫细胞化学反应 免疫细胞化学反应 高电子密度产物 亚细胞水平定位抗原（抗体） 探讨：病因、发病机制，组织发生 优点：定位精确—细胞膜、细胞器 缺点：观察局限；技术难度高 透射电镜生物制品制备技术 1. 取材 原则：1) 快速 2) 块小：0.5~1mm3 3)部位准：肾、胰岛、神经系统 4) 损伤小：器械锋利 5) 低温: 0~4 oC 2.固定 理想固定液：1)迅速渗透 2)稳定细胞结构 3)对组织结构无损伤 4)供细胞化学测定并增强图像反差 常用固定液：锇酸、戊二醛、甲醛 注意：固定液PH值、渗透压维持在生理状态下 NaCI, KCI, 蔗糖，葡萄糖---渗透压 磷酸盐、 二甲砷酸盐缓冲液---PH值 四氧化锇 (osmium tetroxide OSO4)—锇酸 淡黄色结晶，溶液中性，挥发，有毒性 电子反差好，对蛋白尤其膜磷酸脂蛋白，不饱和脂肪酸固定好 对碳水化合物、核酸保护作用差 戊二醛(C5H8O2, glutaraldehyde) 25%,PH4~5, 氧气、高温、中性/碱性可使之聚合，固定作用下降 渗透强，固定快；对糖原，酶及细胞内易变结构如微管保存好 对脂肪保护作用差，电子反差小 甲醛（formaldehyde) 还原剂，易挥发。含10~15%甲醇，对细胞超微结构损伤大 多聚甲醛粉：分子量小，渗透性强，固定迅速，对酶活性保存好 特殊固定方法 1) 双固定法 2.5%戊二醛 4oC, 2h ?缓冲液漂洗 ? 1%锇酸 4oC, 2h 长时间锇酸固定/储存可引起组织变脆，切片困难 2) 灌注固定 CNS、视网膜、肾脏 3. 脱水 原因： 水使电子反差降低 脱水有利于包埋介质均匀渗透 常用： 乙醇：抽提作用小，组织收缩小 与环氧树脂互溶性差 丙酮： 与环氧树脂互溶性好 方法：梯度脱水 脱水时间根据样本性质调整 注意：脱水前充分清洗（锇酸与乙醇可产生沉淀） 4. 浸透 通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂渗透到组织中去 温度： 37oC 时间： 过短---浸透不充分，可造成人为损伤、切片困难 过长---造成对细胞物质的过分抽提 常规：2份纯丙酮+ 1份包埋剂 室温1~2h