血红蛋白的提取与分离2016.pptVIP

构成细胞和生物体结构 的重要物质;血红蛋白的提取和分离;(一）回忆蛋白质;4、基本组成单位;8、蛋白质形成过程;10、颜色反应：;思考;血红蛋白含有四条肽链,每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。;人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物成熟的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;看书：64、65页，思考以下问题：;分离蛋白质的依据：;补充：蛋白质的性质;(三）蛋白质的分离的方法;（三） 凝胶色谱法;原理：; 4.凝胶色谱法的原理—分子筛效应;;;使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中,相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程,可表示为图中?? （??? ）;（四）缓冲溶液;4、常见的缓冲溶液成分;（五）电泳：;③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离;3、类型;蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素;SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小;讨论：如何测定蛋白质的分子量？;第二课时;二、实验操作;;血液;①红细胞的洗涤;c、吸取血浆：用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆;②血红蛋白的释放;磁力搅拌器;③分离血红蛋白溶液;分离血红蛋白溶液;用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体;取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时;;思考;2、纯化——凝胶色谱法;底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底;;（2）凝胶色谱柱的装填;配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至沸腾，通常只需1-2h,可节约时间，也可除去凝胶中的微生物和气泡 ;注意：;装填完连接 洗脱瓶 约50厘米操作压;1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果;装配好的凝胶柱;（3）样品加入与洗脱;③样品渗入凝胶床;开始进行层析;⑥注意：正确的加样操作;讨论：;（三）纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳;血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定;5、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？; 教学反馈 ;5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物;③用于制备分离胶和浓缩胶的Tris缓冲液;⑦样品处理液? 50 mmol/L Tris—HCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇)或用5%的巯基乙醇，2%的SDS，0.1%的溴酚蓝，10%的甘油;1、由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行;① SDS-聚丙烯酰胺分离胶制备;用去离子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的过硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合;（5）