第3章蛋白质的通性、纯化和表征和分.ppt

2 质点大小在1-100nm，可以进行布朗运动 pH小于等电时，蛋白质带正电荷，易与生物碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。 生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、钨酸。 酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸。 （1）前处理；（2）粗分级分离；（3）细分级分离 结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤，结晶不能保证蛋白质是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中占优势时，才能形成该种蛋白的结晶。 影响盐溶，盐析的因素 从电泳结果分：自由界面电泳、区带电泳、盘状电泳 从装置上分： 圆盘电泳（柱状）、水平板电泳、垂直板电泳。 从支持物分： 自由界面电泳、纸电泳（或薄膜电泳）、 凝胶电泳（PAGE ，琼脂糖胶，淀粉胶等） 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex) 洗脱： 低盐高PH 非离子型去污剂（triton x-100) 脂肪醇（丁醇、乙二醇） 酶和激素等：酶活性或激素活性表示（比活性） 其它蛋白：抗原抗体反应(western blot) （六）离子交换层析法 蛋白质样品同离子交换纤维素的结合力取决于彼此相反电荷基团的静电吸引，这与溶液的pH有关，因pH决定离子交换剂与蛋白质的解离程度。同离子交换剂结合力最小的蛋白质首先从层析柱上洗脱下来。 弱酸性的阳离子交换剂一般适合于分离pI＞7.0的蛋白质。 弱碱性的阴离子交换剂一般适合于分离pI＜7.0的蛋白质。 用于蛋白质分离纯化的离子交换剂多为纤维素离子交换剂。常用的阳离子交换剂有羧甲基-磷酸基- 和磺乙基-纤维素；阴离子交换剂有氨基乙基-、二乙基氨基乙基（DEAE-）和三乙基氨基乙基-（TEAE）-纤维素。 交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex-ion exchanger）的优点是既能根据蛋白质分子所带净电荷的数量又能根据蛋白质的分子大小进行分离。 （四）根据选择性吸附的纯化方法：吸附层析法 极性吸附材料：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） 结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]，可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高。 最广泛最有效的材料：羟基磷灰石（hydroxyapatite) 1 羟基磷灰石层析 2 疏水层析 （七）利用配体亲和力的特异生物学亲和力的纯化方法：亲和层析 配基 酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。 免疫亲和层析 凝集素亲和层析 金属螯和层析 染料配体层析 （八） 高效液相层析和快速蛋白质液相层析 高效液相层析（HPLC）实际上是离子交换、分子排阻、吸附和分配层析技术发展的新阶段，提高这些层析方法的分辨率、速度和效率。 反相HPLC广泛用于分离非极性化合物，如药物及其代谢物、杀虫剂、氨基酸和肽，现在也广泛用于蛋白质的分离纯化。 五 蛋白质相对分子量 （一）凝胶过滤法测定蛋白质相对分子量 通过其分子筛效应。 （二）SDS-聚丙烯胺酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量 * 第三章 蛋白质的通性、纯化和表征 一、? 蛋白质的酸碱性质和等电点 等电点 对于某一种蛋白质来说，在某溶液中，它所带的正电荷与负电荷恰好相等（即净电荷为零），该溶液的pH称为蛋白质的等电点。 等离子点 中性盐（Ca2+、Mg2+、Cl - 、HPO42-）影响滴定曲线形状和等电点。盐离子浓度为0时的等电点称等离子点。 等电点测定方法 溶解度法 聚焦电泳法 二、?蛋白质的胶体性质与选择性沉淀 蛋白质分子直径在1-100nm之间，在水溶液中具有胶体溶液的通性（布朗运动，丁达耳现象，不能通过半透膜）。 （一）蛋白质的胶体性质 1 蛋白质表面极性基团形成的水化膜 3 非等电状态时，同种电荷的互相排斥。 （二） 蛋白质的沉淀方法 （1) 盐析法 大量的中性盐[（NH4）2SO4、Na2SO4、Nacl]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。 （2）有机溶剂沉淀法 破坏水化膜，降低介电常数，PEG、丙酮、乙醇等 （3）重金属盐沉淀 pH＞pI时带负电荷，与重金属离子（Hg2+、 Pb2+、Cu2+等）结合形成不溶性物质。 （4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法 （5）加热变性沉淀 （6）等电点沉淀法 蛋白质分子在等电点时静电荷为零，蛋白质分子外的水化层被破坏，分子之间相互凝聚沉淀，蛋白质分子在等电点时，溶解度最低。 三 蛋白质分离纯化的一般原则 纯化的实质 增加制品(preparation