第05章蛋白质的分离纯化和表征王.ppt

蛋白质的分离、纯化、表征 各个解离基团的pK值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据pK值计算，蛋白质的等电点要用等电聚焦等方法测定。 铁的原子量 铁的百分含量 （二）渗透压法测定相对分子质量 公式: R:气体常数 T:绝对温度 C:溶质浓度(g/m3) 实际是测几个不同浓度的渗透压。 不能区别蛋白是否均一。 (三) 蛋白质的扩散和扩散系数 扩散：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。 菲克定律一： 菲克定律二： (四)沉降分析法测定相对分子质量 沉降平衡法 2R Tdln(c2/c1) (1-Ｖρ)Ｗ2(x22-x21) (五)凝胶过滤法测定相对分子质量 凝胶过滤的介质： 多孔网状凝胶珠。 经常使用的凝胶： 交联葡聚糖（Sephadex），聚丙烯酰胺和琼脂糖（Sepharose）。 凝胶过滤的原理：与分子大小和形状有关。 颗粒大的移动快，颗粒小的移动慢。形状接近球体。 测定方法 测几种蛋白质相对分子质量标准物的Ve（洗脱体）。 再测待测样品的Ve。 （六）SDS电泳法测定蛋白质分子量 巯基乙醇：HO–CH2–CH2-SH 能打开二硫键 SDS作用： 电 泳 （七）形 状 X射线晶体结构分析 沉淀、变性、凝固的关系 五、蛋白质分离纯化的方法 2.超滤： 2.密度梯度（区带）离心 3.凝胶过滤 等电点沉淀 2.蛋白质的盐溶和盐析 溶解度与离子强度： 3.有机溶剂分级分离法 优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，溶剂也容易除去。 缺点:有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在低温条件下进行。 4.温度的影响 (三) 根据电荷不同的纯化方法 *双向电泳 3.毛细管电泳 在毛细管中填充具线状缠结聚合物结构的物理凝胶，使样品中各组分通过净电荷差异和分子大小差异双重机制得以分离。CGE在蛋白质、多肽、DNA序列分析中得到成功应用，已成为生命科学基础和应用研究中有力的分析工具。 毛细管电泳 4.等电聚焦 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 (一) 蛋白质含量测定 1.凯氏定氮法 2.双缩脲法 3.福临酚试剂法 4.紫外吸收法 5.染料结合法 6.胶体金法 7.免疫学方法 8.生物活性测定法 (二) 蛋白质纯度鉴定 常用电泳法、HPLC法、免疫学方法、恒浓度法等 本章要求 思考题 某蛋白质的等电点为7.5，在PH6.0的条件下进行电泳，它的泳动方向是： A.原点不动 B.向正极移动 C.向负极移动 D.向下移动 E.向上移动 蛋白质变性时不应出现的变化是: A.蛋白质的溶解度降低 B.失去原有的生理功能 C.蛋白的天然构象破坏　D.蛋白质分子中各种次级键被破坏　E.蛋白质分子个别肽键被破坏 下面哪种方法不属于利用溶解度差别分离纯化蛋白质的方法: A.等电点沉淀 B.盐溶 C.盐析 D.有机溶剂分级分离 E.电泳 利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。 单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节pH的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱 。 (二) 利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀和pH控制 在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 原理：蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子排斥，而与水分子的相互作用加强，溶解度增高。 盐溶：一般在低盐浓度的情况下，中性盐增加蛋白质溶解度的现象。 在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。 当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出的现象。 盐析： 对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定，所采用的盐确定以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度： I = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。常用硫酸铵。 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是乙醇和丙酮。 有机溶剂沉淀法