第四篇电泳技术.pptVIP

第四章 电泳技术;1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。 2 电泳技术优点：快速、准确、重现性好 3 电泳方法分类 按电场分：常压（500V，适用大分子）、高压（500V，适用小分子） 支持体分：自由电泳、区带电泳 仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式 4 电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽） ;一 电泳的基本原理;二 纸电泳;2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。 3 点样 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品） 干法、湿法 4 电泳 电桥水平、加盖、电压稳定、注意时间 5 显色及分析 蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B Aa：茚三酮、靛红 核酸：紫外光下观察 一般洗脱定量 ;三 薄膜电泳;四 薄层电泳;五 凝胶电泳;;;1 聚丙烯酰胺凝胶的制备 丙稀酰胺（单体）＋N,N-甲叉双丙稀酰胺（交联剂）→（催化剂） →聚合 催化剂： （1）过硫酸铵＋四甲基乙二胺（TEMED） （2）核黄素（VitB2）＋光 改变单体浓度可改变凝胶孔径 交联剂对孔径有影响：5％最小 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。;2 不连续电泳中样品压缩成层的原理 不连续电泳含两层或三层不同孔径的凝胶，用不同pH值的缓冲液： 样品胶：大孔径，pH6.7～6.8Tris-HCl缓冲液 浓缩胶：与样品胶相同 分离胶：小孔径，pH8.8～8.9 Tris-HCl缓冲液 ;样品压缩成层原理： 电极缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸 HCl→ (解离） →Cl － ， Cl －泳动速度最快（快离子） CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） → CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P压缩成层 样品进入分离胶后，pH为9.5（电泳过程实测）， CH2(NH2)COO－增加，泳动速度增大，很快超过P， P在均一的电位梯度和pH条件下分离;SDS-凝胶电泳原理;凝胶电泳的操作要点;;;烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化;六 等电点聚焦电泳;1 稳定的pH梯度的形成 2 两性电解质载体 要求： 由多乙烯多胺与丙烯酸加成制备（有不同pH范围的商品两性电解质载体） 3 支持pH梯度的介质 密度梯度溶液（用于自由电泳） 凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点 pH梯度支持介质的制备 聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去;电泳技术思考题