单双波长的使用.pptVIP

单波长和双波长的使用 向玉珍 概念 波长：是在空间或者沿着导线传输的一个波形信号中，相邻周期且同样端点之间的距离。 单波长：就是使用一种对显色具有最大吸收的波长即450或492进行比色测定。 双波长：除了用对显色具有最大吸收的波长外，同时对特异性显色不敏感的波长如630nm进行测定。 问题一 问：酶标仪常用波长有那些？ 答：不同型号的酶标仪安装的滤光片不一样。 如：BIO-RAD-550 标准波长：405、450、490、655 也可选用400~700nm MK3标准波长：405、450、492、630也可选用340~750nm 结合工作中实际情况合理的选择酶标仪型号 问题二 问：为什么试验中的常用波长是450或492nm，少部分是405,而不是其他的波长？ 答：1.了解 市场 2.特定波长：在特定条件下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长 问题二 3.学习两个原理 3.1.TMB DAB+联苯醌（在450nm处有最大的消光系数） So:ELISA中，底物反应显色后，常选择其具最大吸收的波长450比色测定结果。 3.2. pNPP pNP（在405nm处有最大的消光系数） 问题三 问：为什么有的波长需要添加一个副波长？而且常用的是630nm？ 答：1.Madersbacher和Berger做了个实验 首先是用450和405测定一系列的已知浓度的标准本品，证实450/405Z之比为3.2;其次用405测定很低浓度的标准品的OD值再乘以常熟3.2，即为待测样本在波长450的值。 问题三 证明：双波长测定可以提高ELISA的敏感度。 2.每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。 3.630nm下得到的吸光度是非特异性，主要来时于板块上诸如指纹、灰尘，赃物等所致的吸收。 问题四 问：双波长测定时OD结果是如何计算得出的？ 答：样本值=敏感值-非敏感值 敏感波上下 的吸光度测定值为样本测定酶反应特异显色的吸光度与板孔上指纹、刮痕、灰尘等脏物所致的吸光度之和； 非敏感波长下测定即改变波长至一定值，使得样本测定酶 反应特异显色的吸光度值为零，此时测得的吸光度即为脏物的吸光度值。 实验分析1 问题五 问:单波长测定的干扰因素有那些？ 答：1.内源性干扰包括噪音、漂移、电压等 2.表面张力的影响 3.重复性差 问题六 问:双波长测定的优点？ 1.一般不必设空白孔 。仍设空白孔，就可能会出现负值。 2. 能排除由微滴板本身、板孔内标本的非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度的影响的优点。 3.重复性好。 实验分析2 总结 现象：1.单双的结果差异比较大 2.刮花对双波长的影响比较的小 讨论： 结论：运用双波长不会影响灵敏度，反而会减少其他因素的干扰。建议酶免法测定使用双波长，这样可以提高临界值附近样本结果判断的准确度，减少实验误差。 波长选择原理 1.首先要确定显色液的最大吸收峰 联苯联苯醌 ： 450nm 甲苯、二甲苯：465nm 硝基酚 ：405nm 2.结合试剂说明书选择波长 用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需用空白对照孔调零），并记录结果。 HRP\H2O2 AP 刮花前 刮花前 刮花后 刮花后 Thanks for your attention!