实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳.doc

实验八 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 【实验目的】 1.掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术，用于分离蛋白质。 【实验原理】 CH2=CH聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以 CH2=CH C=ONH C=O NH2 C=O NH CH2 C=O NH CH2=CH + AP TEMED NH CH2 C=O NH CH2—CH C=O NH2 —CH2—CH C=O NH2 — CH2—CH— C=O NH2 —CH2—CH C=O NH2 — 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 CH CH2=CH — CH — CH2 —CH— C=O C=O CH CH2—CH— 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离主要依据以下两个因素： 蛋白质所带静电荷：在不同的pH条件下蛋白质所带电荷不同。在一定的电场条件下蛋白质将向与其所带电荷相反的电极方向移动，移动速率取决于蛋白质表面电荷的数量，电压越强或电荷越多则蛋白质移动的越远。其次，蛋白质的形状和大小：蛋白质在电泳中所受的阻力主要取决于样品的大小与凝胶网孔大小之间的关系。蛋白质分子越小或凝胶网孔越大，所分离样品所受阻力就愈小，则在电场中的迁移率就越大。在非变性电泳中，天然蛋白质的分离就是蛋白质所带电荷、分子大小及分子形状等因素共同影响，作用的结果。 电压 x 样品静电荷 迁移率 =? 摩擦力 浓缩效应可显著提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，该效应可通过引入浓缩胶和不连续缓冲溶液系统而获得。浓缩胶处于分离胶的顶部，因此样品在进入分离胶之前首先要经过浓缩胶。它是由较低浓度的丙烯酰胺构成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶网孔大，样品的移动速度较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。 另外，浓缩胶还具有比分离胶更低的pH。浓缩胶内的缓冲溶液是Tris-HCl（pH 6.7）,该pH远低于Tris的pK值(8.1)。分离胶内的缓冲溶液是pH 8.9的Tris-HCl，而电泳正负两极的缓冲溶液均为pH 8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。在浓缩胶中，小分子并带有大量负电荷的Cl-在凝胶中的移动速率较快，而电荷较少且分子量较大的甘氨酸的移动速率较慢。由于二者在同一电场中，具有相同的电流，由此形成的电压梯度导致甘氨酸离子始终跟随在Cl-的后面，带有负电荷的蛋白质样品则浓缩在甘氨酸离子和Cl-之间向正极移动。当样品进入pH 8.9的分离胶时，甘氨酸的解离度增加，在电场中的迁移率高于样品，蛋白质不再夹于两种离子之间向正极移动，这时的蛋白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。 样品缓冲溶液 Tris/HCl pH 6.7Tris/甘氨酸 pH 8.9-+Tris/甘氨酸 pH 8.9分离胶 Tris/HCl pH 8.9浓缩胶 Tris/HCl pH 6.7【实验材料】 样品缓冲溶液 Tris/HCl pH 6.7 Tris/甘氨酸 pH 8.9 - + Tris/甘氨酸 pH 8.9 分离胶 Tris/HCl pH 8.9 浓缩胶 Tris/HCl pH 6.7 1. 实验器材 Bio-Rad公司Mini-ProteanⅡ型电泳仪；电源（电压200V，电流500mA）；100℃沸水浴；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl 2. 实验试剂 试剂号 配方 pH 1 分离胶缓冲溶液 1mol/L HCl 48.0 ml 三羟甲基氨基甲烷 36.3 g 加蒸馏水到100ml 8.9 2 单体交联剂 丙烯酰胺 （Acr） 30g 甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g 加蒸馏水到100ml 3 过硫酸铵 100mg/ml 4 四甲基乙二胺（TEMED） 5 浓缩胶缓冲溶液 1mol/L HCl 48ml 三羟甲基氨基甲烷5.89 g 加蒸馏水到100ml 6.7 6 电极缓冲溶液 甘氨酸 28.8g 三羟甲基氨基甲烷6.0 g 加蒸馏水到1000ml, 用前稀释10倍 8.3 7 染色液 CBB G-250 0.1g 溶于95%乙醇后，加蒸馏水到100ml 8 示踪染料 溴酚蓝 0.05g溶于100ml 蒸馏水 9 样品：蛇毒干粉200mg溶于20ml, pH6.7缓冲溶液（5）中，再加入25%蔗糖20ml和溴酚蓝（8）10ml 凝胶溶液的配方 试剂 分离胶（ml） 浓缩胶(ml) 1 2 5 蒸馏水 3 4 1.25 2.5