实验三血红蛋白吸收和其衍生物光谱分析(终版2012-11-27).pptVIP

3、血红蛋白（Hemoglobin，简称Hb） * * 实验三 血红蛋白及其衍生物 的吸收光谱测定 生物技术专业实验室 王小英 一、实验目的 1、熟悉Hb及其衍生物吸收光谱测定的原理及操作方法。 2、掌握吸收光谱曲线绘制的方法。 1、吸收光谱曲线：将各种波长（?）的单色光依次通过一定浓度的某一溶液，测量该溶液对各种单色光的吸收程度（吸光度A），以?为横坐标，以A为纵坐标，可得到一条曲线，即吸收光谱曲线或称为吸收曲线。 二、实验原理 2、吸收曲线的特点 ①同一种物质对不同波长光的吸光度不同。 吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 。 ②不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。 ③在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 血红蛋白四聚体结构模式 4、Hb及其衍生物 Hb + O2 HbO2 Hb + CO HbCO 吸收峰数量 峰 值 2个 541nm，576nm 2个 540nm，569nm 1个 540nm 1个 555nm HbO2 + K3Fe(CO)6 + NaCN MetHbCN HbO2 Hb + O2 Hb + O2 HbO2 Hb + CO HbCO 500~650nm 图1 HbO2吸收光谱 图2 HbCO吸收光谱 图-3 MetHbCN吸收光谱 图-4 脱氧Hb吸收光谱 三、操作步骤 1、样品制备 （1）HbO2液： 取全血0.1ml（1滴）盛于小烧杯中，加蒸馏水10ml，混匀，此即HbO2液。 （2）MetHbCN液： 取上述氧合血红蛋白约5ml于小试管中，加新鲜配制的10%K3Fe(CN)6 2滴，然后加1滴1%NaCN液，混匀，此即为MetHbCN液。 (3)混匀，静置5min。 2、比色 将以上制备的两种血红蛋白液分别盛于比色杯内，在722型分光光度计上以蒸馏水为空白调节0和100%。在500~650nm分别测定HbO2和MetHbCN液的吸光度（*在相应峰值的10nm范围内每隔5nm记录一次吸光度读数，其余均每隔10nm记录一次吸光度读数）。 四、结果记录及曲线绘制 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标描点，并将各点连接成光滑曲线，即为血红蛋白及其衍生物的吸收光谱。 2、绘制吸收曲线（*并确定最大吸收波长） 1、记录各波长下的A（制成表格） 四、注意事项 1、NaCN溶液是剧毒物，要注意安全，切忌口服，实验完毕注意洗手。 2、取全血前要混匀。 3、比色时每次换波长都要重新调零和100%。 4、绘图时，纵横坐标比例要适当，要用圆滑线把点连起来。