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采样、HA、HI、洗血、配制培养液等步骤 洗血 采样 地点：汕头大学医学院附属第一医院儿科 时间：周一~周五 上午9:00 ~11:00 发烧儿童体温高达37.7℃以上，在7天内出现疑似病毒感染的呼吸道症状，年龄0-18岁，经就诊儿童父母同意采集鼻咽拭子，采完装入采样管，放入冰包，同时做好记录。 采样液配制 以100ml为例： 100ml MEM 10ml PS 1ml 制霉菌素 标本稀释液 100ml MEM 5ml PS(青链霉素) 病毒稀释液 100ml MEM 200ul TPCK胰酶 1ml PS 细胞培养液 100ml MEM 10ml FBS 1ml PS 种标本 HA test 红细胞凝集实验 HI test 红细胞凝集抑制试验 Adjust 4AD Then the HA titer≠4 Cell culture Cell culture flask: S 25cm2 5ml M 75cm2 10~15ml L 175cm2 30ml Dilution ratio/dilutionrate: Two days 1 to 8~10 Three days 1 to 20 Plan Cell culture tube 1ml 96 well plate 96×20ul (1980ul) If you need 200 tubes in 2 days, the plan as follow: Total need cell culture fluid: 20×1ml 20ml/10(dilutionrate for 2 days)=2ml(take 2ml from the 8~10ml of diluted from M flask) If you need 20 96-well plates in 2 days, the plan as follow: Need total volume:20×96×20ul=40ml Cell culture flask:40ml/10=4ml (take 4ml from the 8~10ml of diluted from M flask) * 1ml 肝素可以抗凝 5.5ml血液 心脏抽取豚鼠血液2ml 在离心管里面加PBS至10ml 离心 3000rpm/ 5min 用塑料吸管弃上清，再加PBS至10ml 离心 1 离心 2 离心 3000rpm/ 5min 弃上清，加PBS至10ml 离心 4000rpm/ 10min 去上清，用塑料吸管将血细胞吸入玻璃瓶 加PBS稀释到0.6%，4%保存备用 STUC附属第一医院采取流感症状发热儿童咽拭子 咽拭子在振荡器上面振荡，使棉签中的标本充分溶解于液体中 用移液枪取220ul样本稀释液加入到1ml离心管中 吸取275ul标本液加入该离心管中 振荡、在室温作用1-2小时后离心：10000rpm/ 3min 用PBS将细胞培养管洗两遍 吸取420ul离心后的标本液加入细胞培养管 35℃吸附1-2h 加维持液后放入培养箱里，培养5d，每天观察CPE 阳性 阴性 冻存或者继续接种细胞 盲传，同时冻存 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ H ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ G ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ F ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ E ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ D ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ C ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ B ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ A 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 100ul virus 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 step1: add 50ul PBS in 2-12 step2: add 100ul virus in 1 step3: coubling dilution titer: 1 2 4 8 16 32 64 128