3 分子杂交和Western.pptVIP

一、分子杂交的原理 ③3‘末端标记法 标记的是双链，不破坏完整性。 酶切后必须是3’凹陷 注意事项： 根据不同的酶切位点选择不同的标记核苷酸。 例如：EcoRⅠ位点 5’GAATTC 3‘CTTAAG 不能用于3’凸端的DNA标记。 一般两端标记，否则标记量太少。 5’AATTC 3’TTAAG 只能标记A或C P P P ~ ~ α β γ ④ 5‘末端标记法 5’ 3’ 3’ 5’ P P ~ α β 碱性磷酸酶 γ-32P-ATP T4DNA激酶 P P P ~ ~ α β γ P P P ~ ~ α β γ 注意事项： 只能选γ-32P-ATP，供能。 要求DNA纯度高，末端不能包裹蛋白。 5、探针的纯化 凝胶柱层析纯化法：Sephadex G-50 乙醇沉淀法：DNA在一价盐离子存在时与醇不互溶，在低温 （－20℃）过夜，DNA片段可沉出，离心收集 沉淀，TE溶解即可。 （三）固－液相杂交 杂交体系的建立（复性过程） 杂交温度：Tm－（15-25℃） 加入甲酰胺后固定为42℃ 离子强度：5ⅩSSC或6ⅩSSC 1ⅩSSC：0.15 M Nacl，0.15 M柠檬酸钠 DNA的浓度：先做预实验 探针一般50 μl／cm2为宜 探针长度： 杂交时间：一般24 h（不小于16 h)。 杂交过程 预杂交 起封闭作用，减少非特异性结合 预杂交液 6ⅩSSC 0.5％ SDS 5ⅩDanhart‘s溶液（含有聚乙烯吡咯烷酮，Ficoll 100和BSA三种大分子物质） 50％甲酰胺 100 μg/ml变性鲑精DNA 时间：5－6 h 温度：42℃ 预杂交液的量：0.2 ml/cm2 杂交 在预杂交液中直接加入探针，杂交16－24 h。 洗膜 室温洗： 1ⅩSSC 0.1% SDS 洗15min，洗掉吸附的探针。 65 ℃特异性洗膜 0.1ⅩSSC 0.1％ SDS 洗掉非特异结合的探针，边洗边用盖革计数器测量，直到背景无噪音为止。 放射自显影 －70℃，3天。 Western blot 一、定义 把蛋白质转移到固相支持物上的过程，是一种检测蛋白质表达水平的方法。 二、原理 利用抗原－抗体特异性反应来检测转移至膜上的微量蛋白质 三、过程 1、提取蛋白质 RIPA裂解液 Tris.cl (pH7.5) 50 mM Nacl 150 mM NP-40 1% 脱氧胆酸钠 0.5% SDS 0.1% EDTA 1 mM PMSF 1 mM Na3VO4 1 mM 先用现加 （提取总蛋白，主要是 胞浆蛋白的裂解液） 2、蛋白定量 测定OD280：可测定芳香族氨基酸的含量 考马斯亮蓝G250染色：侧链集团与G250显色，根据深浅测定蛋白质含量。 福林－酚试剂法（Lowry) 肽键＋Cu OH－ 芳香族氨基酸＋磷钼酸、磷钨酸 紫色化合物 蓝色化合物 （苯丙氨酸、酪氨酸） 1 2 3 4 5 6 sampl 1 sam 2 sam 3 1 2 4 8 16 32 10 10 10 (μl) BSA (1 mg/ml) 999 998 996 992 984 968 990 990 990 (μl) NS 浓度 （μg/μl) 1 2 4 8 16 32 + A液 0.9 ml 50℃，10 min + B液 0.1 ml 室温，10 min + C液 3 ml 50℃，10 min 平衡到室温，650 nm测吸光度值 （2