第3章微生物细胞的破碎技术.pptVIP

第3章 微生物细胞的破碎 细胞壁的组成和破碎阻力 真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 各种微生物细胞壁的结构与组成 2 微生物细胞的破碎技术 高压匀浆法 高压匀浆器 高压匀浆法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片细小，胞内物质释放完全 不适合霉菌合格兰氏阳性菌 影响因素 操作压力（50～70MPa） 细胞浓度（20％） 温度 循环次数(2~5) 珠磨法 珠磨法是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 高速珠磨机 珠磨法特点 破碎率较高 适合大规模细胞破碎 碎片较小，胞内物质释放完全 温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备 相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类 影响细胞破碎的因素 搅拌速度（700～1450r/min） 料液的循环速度（50～500L/h） 细胞浓度（0.3～0.5g/mL） 珠粒大小和填充量 （0.45～1mm；70％～90％) 撞击破碎器 电声超声波发生器 细胞破碎主要方法 3 破碎方法的选择 4 破碎率的测定 6. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 5. 基因工程表达产物的后处理 ——包含体的分离与复性 1.直接测定法: 细胞计数 2.测定释放的蛋白质量或酶的活力或相对电导率 33页 破碎动力学 关于破碎率的定义及测定方法 什么是包含体 外源蛋白质基因在受体菌中表达时形成的没有活性的蛋白质聚集体称为包含体。包含体内除目标蛋白外还有微量的质粒，rRNA和RNA聚合酶。 包含体蛋白的一级结构是正确的，但空间折叠错误，故没有生物活性。要得到天然活性蛋白，必须在分离回收包含体后，使包含体重新折叠，恢复天然构象。 包含体形成的原因 蛋白质的多肽链折叠成立体结构的过程中受周围环境的影响，分子间的相互作用影响到分子内的折叠。 包含体形成的原因 一般认为包含体的形成是由于表达的外源蛋白缺少某些折叠的协助因子或局部微环境不适宜，不能正确的形成次级键。 包含体很可能是表达蛋白中间折叠体高浓度积聚在一起形成的不溶物。 包含分离的工艺路线 机械破碎 离心提取包含体 加变性剂溶解 除变性剂复性 化学破碎，溶解包含体（加变性剂） 离心除细胞碎片 除变性剂复性 包含分离的工艺路线 机械破碎 洗滤去除可溶杂质 加变性剂溶解 除变性剂复性 除变性剂复性 机械破碎 加低浓度变性剂洗滤 洗滤去除可溶杂质 加变性剂溶解 冻结—融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的硫水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 * * 知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。 难点：常用破碎方法的合理选用。 胞外产品：各种胞外酶、胞外多糖、细胞代谢物 细胞本身： 单细胞蛋白（SCP） 胞内产品:碱性磷酸酯酶，基因工程产物，植物细胞产物等 1 微生物细胞的破碎技术概述 细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。 酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交联的紧密程度和厚度。 丝状真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围； 最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状， 上面的是一层糖蛋白， 最外层是甘露聚糖，由1,6-磷酸二酯键连接成网状。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物。 破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。 高压匀浆器