改HCCB13086代谢产物的分离检测-赵绅宝20150623.docVIP

HCCB13086代谢产物 的分离纯化 题 目：HCCB13086代谢产物的分离院 （部）：市政与环境工程学院 专 业： 生物工程 班 级： 生物工程112 姓 名： 赵绅宝 学 号： 2011041181 指导教师： 钟传青 殷瑜（上海交通大学） 合作单位： 上海交通大学药学院 完成日期： 2015年6月20日 目 录 目 录 I 摘要 II ABSTRACT III 第一章 前言 - 1 - 1.1研究背景 - 1 - 1.他霉素的 - 3 - 1.1.2纳他霉素活性与稳定性研究 - 5 - 1.1.3纳他霉素的检测方法 - 6 - 1.分离方法 - 9 - 1.2.1相关分离纯化方法介绍 - 9 - - 12 - 1.3本次实验的相关检测方法 - 13 - 1.3.1超高效液相色谱（UPLC） - 13 - 1.3.2质谱（LC-MS） - 15 - 1.3.3二级质谱（MS/MS） - 15 - 1.4本文的研究目的、意义 - 16 - 第二章 工程菌的构建与验证 - 18 - 2.1主要实验材料 - 18 - 2.2实验方法 - 19 - - 19 - 2.2.2 vgb改造菌的扩增与 - 23 - 2.2.3实验结果 - 24 - 2.2.vgb工程菌表达验证 - 25 - - 25 - 第三章 HCCB13086菌代谢产物的分离检测 - 27 - 3.1实验材料 - 27 - 3.2试验方法 - 28 - 3.2.1 纳他霉素产生菌的溶氧验证 - 28 - 3.2. - 28 - 3.2.3种子培养 - 31 - 3.2.4实验结果 - 31 - 3.2.5大量 - 32 - 3.3分离检测实验结果及分析 - 33 - 3.2.1 HPLC半制备 - 33 - 3.2.3 - 34 - 第四章 - 41 - 致谢： - 42 - 参考文献 - 43 - 摘要 纳他霉素是一种二十六元环的多烯大环内酯类天然抗真菌药物，已广泛用于生物性食品防腐剂和人体抗真菌感染药物。褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)是生产纳他霉素的主要菌种。 本文首先通过UPLC-MS对S. gilvosporeus HCCB13086的代谢产物分析发现，该菌除了产生次级代谢产物纳他霉素外，还产生其他一些物质，经过数据库Sciencefinder分析发现分子量为681的物质为一新化合物。为了进一步阐明该化合物的结构以及其与纳他霉素的相关关系，试图对其进行分离纯化、结构解析，但并未获得单一化合物，通过二级MS对该化合物解析推断其为纳他霉素的结构类似物13-OH-natamycin。 通过考察发酵溶氧水平对褐黄孢链霉菌(S. gilvosporeus ) HCCB13086的产抗能力时，发现纳他霉素的产量跟溶氧呈正相关。为了克服溶氧的限制性素，利用异源表达透明颤菌血红蛋白vgb基因的方法，试图提高HCCB13086产纳他霉素的能力。将vgb的整合质粒pSET-ermEP-vgb通过属间接合转移的方法将去甲基化的的质粒转化入S. gilvosporeius中，利用抗性筛选可能的接合子，通过菌落PCR进行验证获得vgb过表达菌株S. gilvosporeius-vgb。通过发酵检测纳他霉素产量发现，S. gilvosporeius-vgb的纳他霉素产量较对照明显提高。 关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；新化合物；透明颤菌血红蛋白；异源表达褐黄孢子链霉菌 ；分离检测； Separation and purification of biological metabolites of HCCB13086 ABSTRACT Streptomyces gilvosporeus is the main strain of production of natamycin. Natamycin is a polyene macrolide a twenty-six membered ring of natural antifungal drug, which has been widely used in biological food preservative and human anti fungal drugs In this study，above all,we find that，besides the bacteria produce secondary metabolites of natamycin, S. gilvosporeus also produced some other substances, through the database Sciencefinder a