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杂交膜的选择 SS膜介绍 不同的杂交过程及其膜选择 SS膜介绍 SS Bioscience公司生产一系列的杂交膜及周边产品，包括Protran、Optitran、Nytran、Nytran SuPerCharge、Westran和Turboblotter。 Protran：硝酸纤维素膜，采用100%的硝酸纤维素，保证膜的高结合能力（其他的硝酸纤 维素膜往往都含有部分的醋酸纤维素，导致结合能力的下降），极低的背景，最好的信噪比，无需严格的洗脱环境。2um孔径的Protran BA83膜可保证分子量小于20kD样品的高结合力，杜绝“blowthrough”现象；0.45um孔径的Protran BA85膜则适合大分子量(20kD)的样品；Protran不需要甲醇预湿处理过程，只需先后在水和转移缓冲液中平衡，即可使用；Protran有着所有的纯硝酸纤维素膜中最好的处理强度 Optitran：Protran硝酸纤维素膜的强化版本，在保持Protran的优点同时提高了强度，在反复切割和标记的情况下，仍能保持良好的信噪比 Nytran N：一般正电荷尼龙膜，可用于Southern、Northern、克隆/噬菌斑移除和斑点/狭线杂交，适合于各种放射和非放射检测方法；2种孔径选择，0.2um用于oligo、0.45um用于DNA大片段(300bp) Nytran SuPerCharge：最高电性的尼龙膜，加强了的电荷及尼龙密度增加了样品结合能力，结合能力是一般正电荷尼龙膜的3倍；其他尼龙膜的9倍。统一的0.45um膜孔径和平均分布有效提高了实验结果的重复性；克服了以往正电荷尼龙膜背景高的弱点，使用各种检测方法都有极佳的信噪比。 Westran 适用于Western和蛋白斑点杂交，0.2um的孔径有效防止“blowthrough”现象发生；适合处理在复杂样品中的小分子量蛋白片断；可以耐受化学性质强烈的试剂，适合用于蛋白测序。 TurboBlotter：快速膜转移试剂盒，使用碱性缓冲液可在1小时内完成膜转移；使用中性缓冲液（SSC）可在3小时内完成，非常方便；所需的缓冲液和滤纸比传统方法少得多，外形也要小很多。 不同杂交的膜选择 核酸的杂交 核酸的杂交主要包括Northern杂交（RNA印迹法）和Southern杂交（DNA印迹法） Northern杂交 2.1.1.1 Northern杂交的定义 测定总RNA或poly(A)RNA样品中特定RNA分子的大小和丰度，RNA分子在变性琼脂糖凝胶中按其大小不同而相互分开，随后将RNA转移至杂交膜上，用放射性DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影，以对待测RNA分子进行作图，其一般步骤包括： 变性RNA的琼脂糖凝胶电泳（乙二醛和二甲基亚砜变性处理或含甲醛的凝胶） 分级分离的RNA转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜 杂交和放射自显影 2.1.1.2 Northern杂交膜的选择 最早是将RNA固定在重氮化纤维素进行Northern杂交，以后由于RNA经乙二醛- DMSO、氢氧化甲基汞或甲醛进行变性处理后牢固结合于硝酸纤维素滤膜，可与放射性标记的探针发生高效杂交，因此逐渐采用硝酸纤维素膜。固定于硝酸纤维素膜的RNA杂交敏感度较高，即使含量占总mRNA 0.001%以下的mRNA组分也可以便利而又迅速地检出并加以定量。 尽管硝酸纤维素膜应用相当成功，但它并非是固相杂交的理想介质。首先，核酸凭借疏水作用而不是共价作用附着于基质上并在杂交和高温漂洗的过程中缓慢释放；其次，硝酸纤维素膜干燥后变脆，顶多能经受一两轮的杂交和漂洗。在使用可与核酸进行不可逆结合且远比硝酸纤维素膜经久耐用的各类尼龙膜后，这一问题便应刃而解：核酸能够与多个不同的探针相继杂交而不损害尼龙膜，同时，因为核酸能够在低离子强度的缓慢液中固定于尼龙上，所以核酸从凝胶向尼龙膜的转移能够以电印迹的形式进行，当DNA的毛细管转移或真空转移不能奏效，这一特点便可利用。此外，处理大张滤膜可不必担心裂损、撕破和卷曲。尼龙膜唯一的缺点是杂交背景趋于增高，尤以使用RNA探针时为甚，因此尼龙膜只用于以许多探针对RNA进行连续杂交的实验。 尼龙膜有两种基本类型：未经修饰的尼龙膜和受电荷修饰的尼龙膜。正电荷尼龙膜表面具有较大的结合容量，更适用于转移和杂交。 尼龙膜在完成转移后必须加以处理以固定DNA，在核酸转移后将尼龙膜彻底干燥或暴露于低剂量的紫外辐射（254nm）下，DNA可得以固定；紫外的方法尽管于健康有害，但由于操作快捷且使核酸与膜共价结合，因而更受欢迎。尼龙膜可以从容耐受多轮杂交而放射信号并不减弱。 2.1.1.3 Nothern杂交的方法 Northern杂交可以采用传统的毛细管转移法（过夜）或者SS Bioscience更新的TurboBlotter，可