真核细胞蛋白质生物合成的研究方法.docVIP

真核细胞蛋白质生物合成的研究方法 研究真核细胞蛋白质合成的方法大致可分为3种，即体内实验(invivo)、溶胞产物合成体系(celllysatesystem)和分步实验体系(fractionatedsystem)。兹简介如下： 一、体内实验 体内实验包括整体实验、组织切片实验和培养细胞实验。在整体实验中，需用同位素标记的氨基酸喂给或注射到受试动物体内，然后测定被研究组织细胞中参入蛋白质的放射性计数，即可知蛋白质合成的速率及总量。因蛋白质不溶于热的三氯醋酸(TCA)，所以只要将细胞用热TCA处理并转移到玻璃纤维膜片上就可作测定，操作比较简便。组织切片实验可在整体实验的基础上作切片的放射自显影观察，也可将切片与标记氨基酸一起保温，再用自显影法或其他方法观察标记物参入位置和数量，培养细胞实验与此类似。以上三种方法中，以培养细胞实验最为可行，因该体系中细胞类型单一，生理状态稳定，标记物用量少。 二、溶胞产物合成体系 溶胞产物合成体系为细胞低渗溶解并去除细胞膜后的组分。它含有完整细胞合成蛋白质所需的全部成分和因子，因而可反映整个细胞的情况。可从不同类型细胞制成溶胞产物合成体系，目前采用最广泛的是兔网织细胞溶胞产物合成体系(简称RRL体系)和麦胚体系。RRL体系的制备较简单：先用苯肼注射于兔子皮下诱导其贫血，然后放血收集网织细胞，加蒸馏水低渗破坏细胞膜，离心取上清液即为溶胞产物。测定蛋白质合成时加入血红素，K+，Mg，能量供应体系和氨基酸(其中一种为标记的)，反应一定时间，再用热TCA沉淀法测其放射性。该体系合成产物是珠蛋白，产物能用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后进行放射自显影，或将胶切成一定厚度的薄片进行液体闪烁测量而予以鉴别，也可用这些方法测定不同合成产物的相对含量和总量。该体系中若加入另一种类外源性mRNA后，也能合成它的蛋白质产物，但与内源性珠蛋白mRNA有竞争作用。 1976年Pelham等在此基础上建立了一个依赖于外源性mRNA的RRL体系，目前已被广泛引用。该体系的制备步骤是：先用微球菌核酸酶(micrococcalnuclease)将RRL内源性mRNA完全降解掉(在酶激活剂Ca存在下)，再用EGTA[1]螯合Ca，使酶失活，此时若加入外源性mRNA，就可进行蛋白质合成。 为了测定某种mRNA合成蛋白质的能力，也可应用mRNA移动检测法(mRNAshiftassay)。该法的基本原理和操作步骤如下：在RRL体系中加入肽链延伸抑制剂稀疏霉素(sparsomycin)，在最适温度和时间条件下保温，然后加入35S-蛋氨酰-tRNA或加入35S-蛋氨酰-tRNA和mRNA，继续保温一定时间，进行蔗糖密度梯度超速离心分析(简称蔗梯分析)。结果显示，光密度表示的离心图谱上呈现核糖体40S亚基峰、核糖体60S亚基峰、核糖体80S单体峰和聚核糖体峰等4个峰。放射性测定结果则显示，当体系中没有外源性mRNA时，35S -蛋氨酰-tRNA不能与mRNA和核糖体形成起始复合物，而只能停留在[35S-蛋氨酰-tRNA-GTP-40S核糖体]复合物阶段，故放射性在40S亚基峰区出现高峰，80S峰区无放射性。当体系中存在mRNA时，蛋白质合成可被起动并形成[35S-蛋氨酰-tRNA-mRNA-80S核糖体]复合物，又由于体系中人为加入肽链延伸抑制剂，故蛋白质合成只能停留在该复合物阶段，此时80S峰区出现放射性高峰。根据80S峰区放射性计数可计算出mRNA的翻译活性。 麦胚体系是将麦胚的匀浆液作为蛋白质合成体系。其基本原理与RRL体系相同。该体系内源性mRNA活性极低，所以可直接测定外源性mRNA的翻译活性，这是一个优点。该体系的缺点是体系的活性随不同种类麦胚差别很大，并且对于分子量大的蛋白质合成，往往会提前中止肽链延伸。 三、分步实验体系 欲研究不同因子或化学药物参与或影响蛋白质合成的详细过程，采用体内实验和溶胞产物合成体系不能解决问题，而必须进一步采用分步实验体系。由于蛋白质合成是由很多环节和步骤所组成，所以分步实验体系可有很多种，要视具体目的而定。总的来说，分步实验就是将参与蛋白质合成的某一步骤的有关组分和因子先行纯化，而后加在一起令其反应，观察特定中间产物的形成情况，并以此判断被研究因子或药物的作用。分步实验体系的最大优点是可以人为地研究各种因素对蛋白质合成的一定过程的影响，其缺点是反应效率低，反应组分的纯化工作难度和工作量都较大。 大头医生/ KKME---专业医学有哪些信誉好的足球投注网站引擎/