植物基因组DNA提取酶切及电泳分析.docVIP

一、目的 掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。 二、原理 十六烷基三乙基溴化胺是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。 三、试剂与器材 （一）、试剂 1 、DNA extraction ：500ml ??31.885g? sorbitol (山梨醇) ??6.05g??? tris?? PH8.2? (一般不调) 2、Nuclei lysis buffer: 500ml ??100ml?????? 1M? Tris PH7.5 ??100ml?????? 0.25M? EDTA ??200ml?????? 5M??? NaCl ??10g???????? CTAB ??100ml?????? ddH2O 3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐)? 500ml ???用时，将上述三种溶液按1：1：0.4 比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/l），65℃预热，既为抽提液。 （二）器材 ??? 恒温水浴、研钵、电泳设备 四、操作步骤 （一）、基因组DNA提取 1 取0.15g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中，加入700?l抽体液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40-60分钟，期间温和混匀几次。 2 取出裂解好的DNA ，加入700?l氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（1000rpm，10分钟）。 3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放半小时以上。 4 将析出的DNA 离心，14000rpm，10分钟。 5 去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，离心 干燥，溶于50?l ddH2O。? （二）、酶切及电泳分析 取四支1.5ml离心管，分别写上标记：g/EcoRⅠ（学号）、g/HindⅢ（学号）、λ/EcoRⅠ（学号）和λ/ Hind Ⅲ（学号）。 前两支试管加入30 ?l基因组DNA。后两支试管加入3?lλ基因组DNA。 前两支加入5 ?l 10×buffer。后两支加入2?l 10×buffer。 前两支分别加入ddH2O 12.5?l，后两支分别加入ddH2O 13?l 分别加入RNase 1 ?l。 前两支试管分别加入1.5 ?l? EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm离心20 S混匀。前两支试管分别加入1 ?l EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm离心20 S混匀。 37℃反应4h 0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。 观察记录并分析实验结果